BIOLOGIA MOLECOLARE

BIOLOGIA MOLECOLARE

(App. IV, I, p. 291)

Gli studi condotti nel ventennio susseguente la scoperta della struttura a doppia elica del DNA (J.D. Watson e F.H.C. Crick, 1953) hanno portato all'elucidazione dei meccanismi responsabili della trasmissione dell'informazione genetica da una cellula madre alla progenie, della decodificazione del messaggio riposto nei geni e della conseguente sintesi delle proteine. Gli anni Settanta e Ottanta, invece, sono stati caratterizzati dallo svilupparsi di quella che viene chiamata la tecnologia del DNA ricombinante. La possibilità di isolare frammenti di DNA dal genoma di qualsiasi organismo, di determinarne la struttura primaria (cioè la sequenza dei nucleotidi che la compongono e quindi l'informazione genetica in essa riposta), e di modificare la struttura dei geni ed eventualmente la loro espressione, ha influenzato molti campi della biologia e della medicina, dalla genetica all'embriologia, dalla patologia allo studio dell'evoluzione. Il termine b. m., pertanto, ha oggi un significato troppo generico in quanto abbraccia conoscenze e tecnologie che richiedono definizioni più specifiche in riferimento ai vari settori di applicazione: genetica molecolare, embriologia molecolare, patologia molecolare, ingegneria genetica, biotecnologia.

Dalla genetica dei microrganismi all'ingegneria genetica. - Lo studio della genetica dei microrganismi ha giocato un ruolo determinante nello sviluppo della b. m. e della tecnologia del DNA ricombinante. La manipolazione del DNA e la sua clonazione è stata resa possibile da tre fondamentali acquisizioni derivate da studi di biochimica e genetica sul colibatterio Escherichia coli e alcuni suoi virus (batteriofagi): a) la scoperta e la purificazione degli enzimi di restrizione che tagliano le molecole di DNA in punti precisi, in corrispondenza di brevi sequenze di basi, caratteristiche per ciascun enzima; b) la scoperta delle ligasi, enzimi capaci di saldare tra loro pezzi diversi di DNA; c) la messa a punto di metodologie per introdurre molecole di DNA ricombinante in cellule batteriche, animali e vegetali. Clonare molecolarmente un frammento di DNA o un gene significa ottenere un clone di cellule batteriche contenenti il DNA di interesse − legato a un appropriato vettore − e capaci di replicare questa molecola di DNA ricombinante come parte del loro patrimonio genetico. Il primo e più semplice vettore utilizzato è il plasmide. I plasmidi sono piccole molecole di DNA circolare capaci di replicarsi autonomamente all'interno della cellula batterica; essi generalmente contengono dei geni che conferiscono ai batteri la resistenza a una svariata gamma di antibiotici. Negli ultimi anni sono state messe a punto varie strategie di clonazione che prevedono l'utilizzo di vettori quali i fagi e i cosmidi (plasmidi capaci di contenere frammenti di DNA di più alto peso molecolare), nonché vettori derivati dal genoma di alcuni virus che permettono la propagazione di molecole di DNA ricombinante in cellule eucariote (vettori eucarioti). La scoperta di geni eucarioti che si estendono per centinaia di kilobasi (1 kilobase è uguale a 1000 paia di basi) nel DNA ha portato al perfezionamento di vettori capaci di propagarsi in lieviti sotto forma di piccoli cromosomi artificiali e capaci di contenere frammenti di DNA fino a 1000 kilobasi. Questi nuovi vettori sono denominati YAC (Yeast Artificial Chromosome = cromosoma artificiale di lievito).

Struttura e replicazione del DNA cellulare. - Lungi dall'essere una rigida struttura con la sola funzione di codificare le sequenze di aminoacidi delle proteine, la doppia elica di DNA è una molecola estremamente plastica e complessa. L'interazione del DNA con particolari proteine dette istoni determina il suo compattamento nel nucleo delle cellule eucariote sotto forma di cromatina. In particolari momenti della divisione cellulare la cromatina viene ulteriormente compattata su un'impalcatura, costituita da proteine acidiche, per formare i cromosomi, il cui numero e forma sono specifici per ogni specie animale e vegetale (v. genetica, XVI, p. 509; App. II, i, p. 1022; III, i, p. 716, IV, ii, p. 7; e cromosoma, in questa Appendice). Per il mantenimento delle caratteristiche di una specie tutte le informazioni contenute nel DNA devono essere replicate a ogni singola divisione cellulare. Anche se il processo di replicazione del DNA è abbastanza accurato, possono occasionalmente avvenire degli errori che modificano la sequenza nucleotidica del DNA, che a sua volta verrà trasmessa nella forma alterata nella replicazione successiva. L'insorgenza di errori da parte del meccanismo replicativo, generalmente chiamati mutazioni, e di altri errori connessi con la plasticità e la mobilità del DNA come le traslocazioni, le trasposizioni e gli eventi di ricombinazione, se da un lato garantisce la diversità genetica esistente tra le diverse specie e tra gli individui della stessa specie, dall'altro lato è spesso anche la causa di un gran numero di malattie a determinazione genetica e di numerose altre patologie non ereditarie, compreso il cancro.

Struttura dei geni e loro espressione. - Nel genoma degli organismi procarioti i geni sono contigui e spesso raggruppati in unità regolative dette operoni, i cui membri vengono espressi in maniera coordinata. Negli organismi eucarioti i geni sono invece dispersi nelle molecole di DNA e ne rappresentano solo una piccolissima frazione; il resto è costituito da sequenze di nucleotidi generalmente ripetute, la cui funzione non è ancora nota.

La struttura dei geni eucarioti è più complessa rispetto a quella dei procarioti, poiché le sequenze che codificano gli aminoacidi delle proteine, gli esoni, sono interrotte da sequenze non codificanti, gli introni, che spesso costituiscono la frazione preponderante dei nucleotidi dei geni stessi. Negli eucarioti, inoltre, non sono presenti unità di regolazione analoghe agli operoni dei procarioti e l'espressione di ogni gene è regolata singolarmente mediante meccanismi che solo oggi cominciano a essere compresi. Infatti in prossimità di ogni gene esistono delle sequenze specifiche, dette promotori, coinvolte nel controllo dell'espressione genica. I promotori interagiscono con dei fattori specifici, fattori della trascrizione, che sono a loro volta proteine codificate da geni la cui funzione è quella di controllare l'espressione di altri geni.

L'espressione di un gene può essere regolata nel tempo e nello spazio come durante il ciclo di divisione cellulare, lo sviluppo embrionale e il differenziamento cellulare o in risposta a particolari stimoli esterni quali fattori della crescita od ormoni. Tale regolazione avviene attraverso l'interazione dei promotori con fattori specifici della trascrizione e l'interazione di diversi fattori tra di loro. Alcuni geni codificano per fattori della trascrizione responsabili della predeterminazione spaziale delle cellule embrionali in un organismo e del tipo di differenziamento a cui queste andranno incontro e vengono pertanto detti geni omeotici. L'alterazione dell'espressione di geni codificanti fattori della trascrizione, o comunque proteine coinvolte nella regolazione dell'espressione genica (recettori e trasduttori), è stata indicata come la causa dell'insorgenza di alcuni tumori. Tali geni, anche sulla base della loro omologia con geni di virus oncogeni, sono detti oncogeni.

Struttura e funzione delle proteine. - Il clonaggio e la determinazione della sequenza nucleotidica di numerosi geni e quindi della sequenza aminoacida delle proteine da essi codificate ha rivoluzionato completamente il modo di studiare la struttura e la funzione delle proteine. La tecnologia del DNA ricombinante consente di introdurre una svariata serie di mutazioni in un gene e di saggiarne le conseguenze sulla funzione o attività biologica della proteina mutata codificata, dopo la reintroduzione ed espressione in appropriati sistemi cellulari. Questa metodologia ha permesso l'identificazione e la definizione di tutta una serie di domini proteici funzionali tipici di diverse proteine. Sono stati identificati i domini proteici comuni a molti recettori, che permettono il loro ancoraggio alla membrana cellulare, domini proteici responsabili dell'azione catalitica di molti enzimi e ancora domini responsabili dell'interazione delle proteine col DNA (detti zinc fingers), o responsabili dell'aggregazione di fattori diversi che cooperano nella regolazione dell'espressione genica (detti leucine zipper).

Biologia molecolare e medicina. - I vantaggi derivati dall'isolamento dei geni responsabili di numerose malattie a determinazione genetica sono stati affiancati dallo sviluppo di metodologie sempre più sensibili per l'identificazione e l'analisi di mutazioni geniche. I geni isolati, indipendentemente dai loro prodotti proteici, costituiscono oggi degli strumenti diagnostici di notevole interesse. Grazie alla specificità dell'interazione tra catene complementari di acidi nucleici, geni o porzioni di essi, opportunamente marcati con radioisotopi, possono essere utilizzati come sonde molecolari per rivelare la presenza di sequenze nucleotidiche omologhe in campioni di DNA ottenuti da cellule prelevate da pazienti.

Questa metodologia, denominata Southern blotting dal suo inventore E.M. Southern, ha permesso l'identificazione di mutazioni, delezioni, riarrangiamenti e amplificazioni di geni cellulari, connessi a vari tipi di patologie, nonché la definizione di polimorfismi del DNA associati con difetti genetici (RLFP, Restriction Fragment Lenght Polymorphism).

Lo sviluppo di altri metodi di studio di sequenze geniche da DNA bioptico, come le tecniche di ibridazione molecolare che utilizzano marcature non isotopiche, associati a sistemi che permettono la risoluzione di porzioni sempre più grandi del genoma (elettroforesi pulsata su gel di agarosio: PFGE, Pulsed Field Gel Electrophoresis; FIGE, Field Inversed Gel Electrophoresis; OFAGE, Orthogonal Field Agarose Gel Electrophoresis), o l'utilizzo dell'amplificazione di segmenti specifici del genoma tramite reazioni di polimerizzazione a catena (PCR, Polymerase Chain Reaction), promette di espandere in un prossimo futuro lo spettro di applicazione e la sensibilità dei sistemi di diagnosi di alterazioni genomiche, e di migliorare in maniera oggi non prevedibile la nostra abilità nell'identificare quali meccanismi molecolari sono connessi con le patologie del genoma umano e con eventi quali la trasformazione neoplastica.

Bibl.: B. Lewin, Il gene, trad. it., Bologna 1985; B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J. D. Watson, Biologia molecolare della cellula, trad. it., ivi 1989; J. D. Watson, N. H. Hopkins, J. W. Roberts, J. Steitz, A. M. Weiner, Biologia molecolare del gene, trad. it., ivi 1989; S. F. Gilbert, Biologia dello sviluppo, trad. it., ivi 1989.