CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFIA (dal gr. χρῶμα, χρώματος "colore" e γράϕω "scrivo")

Metodo di analisi chimica basato sul seguente principio: se attraverso uno strato, per es. di carbonato di calcio finemente polverizzato (sostanza adsorbente) contenuto in un tubo di vetro t (v. fig.) appoggiato, alla base, su di un setto poroso s che serve da sostegno, si fa passare la soluzione - in solvente appropriato - di un miscuglio di sostanze, alcune di esse vengono adsorbite cioè "fissate" dal carbonato di calcio più fortemente ed altre meno. Quelle più fortemente adsorbite rimangono nella parte superiore della colonna di carbonato di calcio - colonna cromatografica - quelle meno fortemente adsorbite nella parte inferiore, in modo che i singoli costituenti il miscuglio, a seconda della loro affinità per l'adsorbente, vengono a fissarsi ad altezze diverse della colonna cromatografica.

Due sono i fattori concomitanti che agiscono nel senso di provocare la separazione dei diversi costituenti il miscuglio: a) le sostanze che hanno minor afffinità per l'adsorbente sono pure quelle che dal solvente, una volta adsorbite, possono venir più facilmente allontanate e quindi convogliate nella parte inferiore della colonna cromatografica; b) le sostanze che hanno maggior affinità, non solo sono difficilmente riportabili in soluzione (eluibili), ma sono pure in grado di spostare dall'adsorbente quelle ad affinità minore, in modo che esse rimangono fissate nella parte superiore della colonna e le altre vengono spostate verso la parte inferiore.

Se il miscuglio è costituito da sostanze diversamente colorate, facendo fluire attraverso la colonna una certa quantità di solvente puro, che può essere lo stesso usato per preparare la soluzione oppure un altro, opportunamente scelto, nella colonna si noteranno delle zone diversamente colorate che si distanzieranno sempre più le une dalle altre col procedere di questa operazione che prende il nome di sviluppo del cromatogramma". In ogni zona resta fissato uno dei costituenti il miscuglio di partenza. Le figure della tavola a colori rappresentano colonne cromatografiche nei diversi stadî del loro sviluppo.

L'esecuzione pratica dell'analisi cromatografica comprende le seguenti operazioni:

1) Preparazione della colonna cromatografica. La sostanza adsorbente come tale, o sospesa nel solvente in cui verrà sciolto il miscuglio, è versata nel tubo di vetro t, avendo cura che sopra lo strato di materiale rimanga sempre un piccolo battente di solvente.

2) Soluzione del miscuglio da esaminare. Il miscuglio è sciolto in un solvente adatto in modo da ottenere una soluzione limpida e diluita dalla quale il soluto non deve cristallizzare.

3) Introduzione della soluzione nella colonna. Si versa lentamente la soluzione nel tubo t in modo che attraversi, lentamente, lo strato a, aiutando eventualmente il deflusso del liquido in b′ con una leggera aspirazione operata per mezzo del tubo laterale b.

4) Sviluppo del cromatogramma. Si esegue facendo fluire lo stesso solvente impiegato al punto 2, oppure altri convenientemente scelti, in modo che abbiano ad effettuarsi le condizioni di cui ai punti a) e b).

5) Separazione dei diversi strati. Terminato lo sviluppo si lascia defluire completamente il solvente impiegato e, allontanando il tubo t dal supporto s, si svuota il contenuto mediante il pistone di legno c in modo che l'adsorbente, ancora umido, mantenga la sua forma cilindrica. Con un coltello si suddividono le diverse zone della colonna.

6) Eluizione delle singole zone. Questa operazione consiste nel trattare le singole zone con un solvente della sostanza adsorbita (eluente) in modo da allontanarla completamente dall'adsorbente che si separa poi per filtrazione.

7) Isolamento dei costituenti il miscuglio. I singoli eluati vengono elaborati coi comuni metodi di laboratorio per isolare da essi la sostanza disciolta che di solito è costituita da uno solo dei componenti il miscuglio di partenza: se ciò non fosse si ripete tutta l'operazione sulle singole frazioni.

Le operazioni 5-7 possono venire sostituite da un'unica operazione eseguendo un'eluizione frazionata della colonna, continuando cioè l'operazione 4 e raccogliendo in b′, separatamente, le diverse frazioni di solventi impiegati. L'operazione sarà finita quando il peso del residuo delle singole frazioni, private del solvente, sarà uguale a quello del miscuglio di partenza.

Con questo sistema, di applicazione generale, si possono separare dai loro miscugli anche sostanze non colorate per le quali il processo di separazione non è eseguibile osservando la colonna ad occhio nudo.

In tal caso è utile esaminare lo spostamento delle diverse zone con la luce ultravioletta (ultra-cromatografia o cromatografia di fluorescenza) impiegando tubi di quarzo.

Con lo svilupparsi dell'impiego del metodo cromatografico il numero delle sostanze adsorbenti usate è andato aumentando. Così oltre al carbonato di calcio si usano l'ossido di alluminio, l'idrossido di calcio, l'ossido di magnesio, l'amido, lo zucchero e anche alcune resine organiche. Talvolta si impiegano anche miscugli di queste sostanze: per la loro scelta bisogna tener presente che esse non devono disciogliersi nei solventi impiegati né reagire con essi o con le sostanze da separare.

Anche i solventi del miscuglio e quelli che si usano per lo sviluppo e l'eluizione sono i più svariati; in genere si comincia con quelli di minor potere eluente per passare a quelli di potere eluente maggiore tenendo conto che devono essere solventi a punto di ebollizione abbastanza basso e molto differente da quello delle sostanze da isolare. Così, per sostanze organiche ed impiegando allumina come adsorbente, si può usare l'etere di petrolio per poi passare al benzolo, all'etere etilico e, infine, all'alcool metilico.

Il metodo cromatografico, reso noto dal Tswett fra il 1906 e il 1910 restò inapplicato per oltre un ventennio. E merito specialmente delle scuole di P. Karrer, di R. Kuhn, di A. Windaus e di H. Euler di averlo riportato alla ribalta, impiegandolo, con buon successo, per l'isolamento di principî di alto valore biologico (vitamine, ormoni, enzimi, ecc.) ed apportandovi dei perfezionamenti che ne permettono un più vasto impiego non solo in tutti i campi della chimica organica biologica ed analitica, come mezzo di indagine nei laboratorî, ma anche nella pratica industriale per la purificazione e l'isolamento di alcune sostanze. Le principali realizzazioni sono state: la separazione e l'isolamento delle provitamirie ad azione antixeroftalmica, e della vitamina A (1931-33), l'isolamento della vitamina antirachitica (1936), lo studio di alcuni cofermenti come la cozimasi e la codeidrasi (1936).

Bibl.: L. Zechmeister e L. v. Cholnoky, Die Chromatographische Adsorptions-methode, Vienna 1937; I. N. Wilson, in J. Am. Chem. Soc., LXII (1940), p. 1583; A. J. P. Martin e R. L. M. Synge, in Biochem. J., XXXV (1941), p. 1358; D. De Vault, in J. Chem. Am. Soc., LXV (1940), p. 532; I. Weiss, in J. Chem. Soc., 1943, p. 297.