ENZIMI

ENZIMI

(XIV, p. 44; App. II, I, p. 856; III, I, p. 558; IV, I, p. 697)

Nell'ultimo decennio, nuovi e. sono stati scoperti e caratterizzati. In particolare, le ricerche di enzimologia sono state indirizzate allo studio delle proprietà cinetiche, del meccanismo di azione e delle possibili applicazioni delle conoscenze fin qui acquisite, sia sui nuovi e. che su quelli già noti da tempo.

Cinetica enzimatica. - Gli studi recenti di cinetica enzimatica hanno portato alla definizione di una nuova costante, denominata kcat, che rappresenta la velocità catalitica massima di un e. qualunque quando il substrato è presente in concentrazione saturante.

Se la concentrazione del substrato è molto maggiore della costante di Michaelis-Menten K_m dell'e. corrispondente, la velocità della catalisi enzimatica corrisponde al valore della k₃ (v. App. IV, i, p. 702). In condizioni fisiologiche, però, quasi tutti gli e. si trovano in presenza di concentrazioni sottosaturanti dei rispettivi substrati. Infatti, il rapporto S/K_m è normalmente compreso tra 0,01 e 1,0 e quindi, come spesso accade, se il valore di S è molto più piccolo del valore di K_m, la velocità della reazione enzimatica è molto inferiore al valore di k₃ poiché la maggior parte dei siti dell'e. per il substrato non sono occupati. In questo caso, il valore di V può essere determinato dalla seguente equazione:

In queste condizioni la concentrazione dell'e. libero E è praticamente uguale alla concentrazione totale dell'e. Et, perciò l'equazione può essere riscritta come segue:

Quindi, quando [S] molto minore di K_m, la velocità della catalisi enzimatica dipende dal valore del rapporto k₃/K_m e dalla [S]. Poiché k₃/K_m = k₃·k₁/k₂+k₃ è minore di k₁, il valore di k₃/K_m dipende dai valori di k₁, k₂ e k₃, e il suo valore minimo è regolato da k₁ che è la velocità della formazione del complesso ES il cui valore è strettamente dipendente dalla velocità di diffusione del substrato nel mezzo di reazione. Questo valore non può essere superiore a 10⁸ − 10⁹M⁻¹s⁻1 e quindi determina il limite superiore del rapporto k₃/K_m.

Questa regola è valida anche per quegli e. che posseggono delle reazioni più complesse di quelle rappresentate dallo schema fondamentale delle reazioni enzimatiche:

In questi casi, la loro velocità catalitica massima, in condizioni saturanti di substrato, viene espressa dal valore di una nuova costante denominata kcat, che dipende da diverse costanti di velocità oltre che da k₃. Per questo tipo di e. il parametro più appropriato per esprimere la velocità catalitica massima (sempre ovviamente in condizioni saturanti di substrato) è il rapporto kcat/K_m. Per es., gli e. acetilcolinesterasi, carbonicoanidrasi e triosofosfatoisomerasi hanno un valore di kcat/K_m compreso tra 10⁸ e 10⁹M⁻¹s⁻1, a conferma del fatto che, in questi casi, la loro velocità di reazione è limitata solamente dalla velocità con la quale incontrano i rispettivi substrati in soluzione, cioè dalla velocità di diffusione del substrato nel mezzo di reazione.

Il tempo di diffusione del substrato risulta diminuito nei cosiddetti ''sistemi multienzimatici complessi''. Infatti, in tali sistemi, esiste un'associazione tra e. differenti, che catalizzano perciò reazioni differenti, in cui il prodotto della reazione di un e. è il substrato di un altro e. a esso associato. In tal modo, il prodotto della prima reazione è canalizzato verso l'e. successivo per il quale esso funge, come detto, da substrato, producendo, in ultimo, una netta diminuzione del tempo di diffusione del substrato che risulta confinato nel volume molto ridotto del complesso multienzimatico.

Nell'ambito dello studio dei meccanismi di inibizione delle attività enzimatiche va ricordato, accanto all'inibizione competitiva e non competitiva, il cosiddetto ''fenomeno dell'inibizione acompetitiva'', piuttosto frequente nelle reazioni enzimatiche a due substrati e più raramente riscontrabile in quelle a substrato singolo. In questo tipo di inibizione, l'inibitore non interagisce con l'e. libero e non influenza neanche la reazione tra l'e. stesso e il suo substrato, ma, viceversa, si lega al complesso ES (che normalmente dà l'e. libero E e il prodotto P), formando un complesso inattivo e.-substrato-inibitore che impedisce la formazione del prodotto di reazione:

La costante di inibizione di quest'ultima reazione è data da:

Caratteristica dell'inibizione acompetitiva, come evidente dal grafico riportato in fig. 1, è quella di influenzare contemporaneamente la K_m e la V_max dell'e., mantenendo però invariata la pendenza K_m/V_max delle rette ottenute nel grafico 1/V in funzione di 1/[S].

Come detto precedentemente, questo tipo di inibizione è caratteristico delle reazioni enzimatiche a due substrati che possono essere genericamente suddivise in: reazioni a spostamento singolo e reazioni a spostamento doppio.

Reazioni a spostamento singolo. - In questo tipo di reazioni i substrati A e B devono essere presenti contemporaneamente sul sito catalitico dell'e. per formare un complesso EAB affinché la reazione proceda verso la formazione dei prodotti. La sequenza con cui i substrati reagiscono con l'e. può essere casuale o ordinata. Se la sequenza è casuale, i substrati si possono combinare con l'e. indifferentemente secondo gli schemi:

oppure:

Un esempio molto importante di reazione a spostamento singolo casuale è la reazione catalizzata dalla creatinchinasi:

ATP + creatina ↔ ADP + creatinfosfato

In questa reazione sia l'ATP che la creatina si possono legare in qualunque sequenza alla creatinchinasi, così come, dopo il trasferimento del gruppo fosforico dell'ATP alla creatina, entrambi i prodotti (ADP e creatinfosfato) si possono staccare dal sito attivo dell'e. in qualunque sequenza.

Viceversa, nelle reazioni a spostamento singolo ordinate esiste una sequenza precisa con cui i due substrati si devono legare all'enzima. Così, per es., nella reazione catalizzata dalla malico deidrogenasi:

acido malico + NAD⁺ ↔ acido ossalacetico + NADH + H⁺,

il NAD⁺ si deve legare per primo all'e. formando il complesso E-NAD⁺ e, successivamente, ad esso si lega l'acido malico formando il complesso ternario E-NAD⁺−acido malico.

Reazioni a spostamento doppio. - In questo tipo di reazioni, il primo substrato deve essere trasformato nel primo prodotto (che deve essere anche rilasciato) prima che il secondo substrato possa legarsi all'e. e possa quindi venire rilasciato il secondo prodotto.

Per es., nella reazione catalizzata dall'aspartatoamminotransferasi:

acido aspartico + acido α−chetoglutarico ↔ acido ossalacetico +

+ acido glutammico,

l'acido aspartico (primo substrato) si lega per primo all'enzima. Il gruppo amminico dell'acido aspartico viene trasferito sul gruppo prostetico dell'e. (in questo caso è il piridossalfosfato) e quindi l'acido ossalacetico (primo prodotto) viene rilasciato. Al suo posto si lega l'acido α−chetoglutarico, sul quale viene trasferito il gruppo amminico del primo substrato (acido aspartico) per formare acido glutammico che viene, a sua volta, rilasciato (secondo prodotto).

Meccanismo di azione degli enzimi. - Un gruppo di e., il cui meccanismo d'azione è stato studiato in modo molto approfondito negli ultimi anni, è quello costituito dagli e. proteolitici, nei quali il residuo amminoacidico di serina è indispensabile per la loro attività catalitica (per tale motivo sono anche detti ''proteasi a serina''). Il ruolo di questi e. negli organismi superiori è fondamentale per il corretto svolgimento di numerosi processi biologici quali la digestione e la coagulazione del sangue. Gli studi condotti sulla chimotripsina, la quale scinde i legami peptidici in cui uno dei due amminoacidi è un amminoacido aromatico o con una catena carboniosa apolare, hanno evidenziato che il gruppo OH di un residuo amminoacidico di serina in posizione 195 forma un legame acilico covalente con il gruppo carbossilico del substrato da idrolizzare. La struttura covalente e.substrato viene stabilizzata dal fatto che la catena laterale dell'amminoacido apolare o aromatico viene posizionata in una nicchia idrofobica adiacente al sito catalitico dell'enzima.

In questo meccanismo vi sono altri due residui amminoacidici della chimotripsina, che risultano fondamentali per la corretta attività catalitica dell'e.: un'istidina in posizione 57, che, oltre ad accentuare la nucleofilicità dell'ossidrile della serina 195, accetta un protone dalla serina consentendo a quest'ultima di attaccare il carbonio del gruppo carbonilico del substrato; un acido aspartico in posizione 102, che, essendo carico negativamente, interagisce con l'istidina 57 carica positivamente, stabilizzandone la struttura ionica. Quindi, questi 3 residui amminoacidici, più il substrato, formano una struttura tetraedrica che rappresenta lo stato di transizione di questa prima semi-reazione enzimatica di acilazione. La seconda semi-reazione è costituita dalla deacilazione della chimotripsina, che, avendo già liberato l'amminoacido il cui gruppo amminico era legato mediante legame idrogeno all'istidina 57, libera l'amminoacido che era legato covalentemente alla serina 195. Lo schema completo di questa reazione enzimatica è riportato in fig. 2. Questo meccanismo di azione è comune a tutti gli e. proteolitici nei quali una serina è indispensabile per la loro attività catalitica. Tra questi bisogna ricordare la tripsina e l'elastasi, che, pur catalizzando anch'essi la scissione idrolitica del legame peptidico, possiedono una specificità di substrato diversa da quella della chimotripsina. Infatti, la tripsina idrolizza solo quei legami peptidici nei quali uno dei due amminoacidi è un'arginina o una lisina, mentre l'elastasi idrolizza solo quelli nei quali uno dei due amminoacidi del legame peptidico è un amminoacido con una corta catena laterale priva di carica (per es.: glicina, alanina, ecc.). Le differenze di specificità di substrato tra questi 3 e. proteolitici sono dovute alla diversa sequenza amminoacidica della ''tasca'' all'interno della quale s'inserisce la catena laterale di uno degli amminoacidi che sono coinvolti nel legame peptidico da idrolizzare.

Così, mentre la tasca della chimotripsina è costituita da amminoacidi idrofobici, quella dell'elastasi è anch'essa formata da amminoacidi idrofobici, ma le catene laterali di due di essi (non presenti nella chimotripsina) sporgono all'interno della tasca, impedendo l'accesso a quegli amminoacidi in possesso di una catena laterale ingombrante. Viceversa, la tripsina presenta al centro della sua tasca un residuo di acido aspartico (non presente in quella posizione né nella chimotripsina né nell'elastasi), la cui catena laterale, essendo carica negativamente, è in grado di interagire elettrostaticamente con le catene laterali cariche positivamente della lisina e dell'arginina, la cui presenza nel legame peptidico è indispensabile perché la tripsina ne possa catalizzare l'idrolisi. La somiglianza piuttosto evidente nella sequenza amminoacidica complessiva di queste tre proteasi suggerisce che esse si siano evolute da un e. ancestrale comune. Il gene che codificava per questo ''e. antenato'' si sarebbe duplicato molte volte. Mutazioni casuali in questi duplicati del gene avrebbero portato all'espressione di questi e. proteolitici diversi. Questo tipo di meccanismo evolutivo di duplicazione e mutazione di geni discendenti da un antenato comune è chiamato evoluzione divergente. Diversamente, l'evoluzione convergente indipendente è quella che riguarda e. (e proteine) che, pur svolgendo una funzione simile, non presentano particolari analogie nella loro struttura primaria, i loro siti attivi risultano abbastanza differenti, la loro struttura tridimensionale non presenta quasi alcuna somiglianza. Per es., nell'ambito del gruppo degli e. proteolitici delle proteasi a serina, questo tipo di situazione si riscontra paragonando la chimotripsina con la subtilisina, e. di origine batterica.

Un altro gruppo di e. particolarmente studiato negli ultimi anni, per la determinazione del meccanismo di azione, è quello delle ribonucleasi. In particolare, la ribonucleasi A è stata l'e. caratterizzato in modo più approfondito. Questo e. viene sintetizzato dal pancreas ed è responsabile della degradazione delle molecole di RNA. La ribonucleasi A è costituita da 124 amminoacidi e ha un peso molecolare di 13700. I legami scissi dalla ribonucleasi A sono quelli fosfodiesterei che legano i nucleotidi tra di loro: in particolare, da un dinucleotide (substrato dell'e.) si formeranno un nucleoside (il nucleotide privo della molecola di fosforo inorganico) e un nucleotide al quale è attaccato in posizione 3′ il gruppo fosforico libero. La caratteristica di questa reazione è la formazione di un prodotto intermedio che precede il rilascio del nucleotide-3′fosfato ed è rappresentato dal nucleotide-2′, 3′−fosfato ciclico.

Questo composto, che è stato isolato come prodotto della catalisi della ribonucleasi A, subisce una idrolisi spontanea irreversibile a seguito della reazione con una molecola di acqua che libera il nucleotide-3′−fosfato e uno ione H⁺. Inoltre, perché l'e. possa scindere il legame fosfodiestereo, la base azotata sul lato 3′ del dinucleotide deve essere costituita da una pirimidina, poiché l'anello delle purine provocherebbe una distorsione del sito attivo con conseguente perdita della capacità catalitica della ribonucleasi A. Infatti, la citosina e l'uracile (basi pirimidiniche) interagiscono esattamente col sito catalitico dell'e., formando con esso legami idrogeno. Nonostante le somiglianze esistenti tra la molecola dell'RNA e quella del DNA a singola elica, la specificità di substrato della ribonucleasi A per l'RNA è pressoché assoluta. Questo è dovuto al fatto che il DNA, possedendo il desossiribosio al posto del ribosio come costituente saccaridico della sua struttura molecolare, manca di un gruppo ossidrilico in posizione 2′, che impedisce la ciclizzazione 2′−3′ del gruppo fosforico del nucleotide idrolizzato.

Molecole non proteiche dotate di attività enzimatica. - Una delle più recenti scoperte nel campo delle ricerche sugli e. è quella legata alla possibilità che non siano solo le proteine a possedere la capacità di catalizzare reazioni di tipo enzimatico. Infatti, è stato dimostrato che molecole di RNA possono comportarsi come e. estremamente efficienti. L'esempio più studiato e caratterizzato è quello dell'RNA L-19, che è un precursore dell'RNA ribosomiale appartenente al protozoo Tetrahymena termophila. Questa macromolecola (non proteica) catalizza specificamente il legame e la scissione di substrati costituiti da oligoribonucleotidi. In particolare, dall'oligoribonucleotide pentacitidilato si formano, in presenza di RNA L-19, sia tetra- e tricitidilato che esacitidilato.

Questi esperimenti, che hanno valso nel 1989 il premio Nobel per la chimica al ricercatore T. Cech, dimostrano che questa molecola di RNA ha contemporaneamente le caratteristiche di una ribonucleasi e di una RNA-polimerasi.

Da un punto di vista cinetico, l'RNA L-19 obbedisce alla legge di Michaelis-Menten, possedendo nei confronti del substrato pentacitidilato una K_m uguale a 42 μM e una kcat uguale a 0,033 s⁻¹. La sua specificità per il substrato è evidenziata dal fatto che essa catalizza le reazioni descritte soltanto sugli oligoribonucleotidi nei quali le basi azotate sono citosina e uracile e non adenina e guanina. Inoltre, la presenza di un ossidrile in posizione 2′ sulla molecola saccaridica del nucleotide è indispensabile perché la reazione avvenga; infatti, è stato osservato che i desossiribonucleotidi agiscono da inibitori competitivi nei confronti del substrato dell'RNA L-19. Quindi, in base a queste acquisizioni, si può affermare che questo tipo di RNA possiede le caratteristiche principali di un e., e cioè: elevata specificità per il substrato, caratteristiche cinetiche che rispondono all'equazione di Michaelis-Menten ed esistenza di inibitori competitivi della reazione.

Il valore del rapporto kcat/K_m dell'RNA L-19 è pari a 10³M⁻¹s⁻1 ed è circa 5 volte inferiore ai valori degli e. proteici cataliticamente più efficienti. Ciononostante, questo valore, che è simile al valore della ribonucleasi A (e. proteico che catalizza lo stesso tipo di idrolisi dei ribonucleotidi), è circa 10 volte maggiore di quello dell'idrolisi spontanea del pentacitidilato, dimostrando pertanto la ''natura enzimatica'' della reazione catalizzata dall'RNA L-19. Gli studi fin qui condotti sulla struttura di questi RNA dotati di attività enzimatica (detti ribozimi) e sulla natura delle interazioni con i loro substrati hanno evidenziato l'impossibilità da parte di queste macromolecole di formare al loro interno delle zone idrofobiche e inoltre hanno sottolineato la minore possibilità di variazione dei loro siti attivi (va infatti ricordato che le unità ripetitive degli RNA, i ribonucleotidi, sono solo 4 a differenza di quelle delle proteine, gli amminoacidi, che sono 20).

Questi due fattori rendono conto del perché la grandissima maggioranza degli e. sono proteine. Comunque, la scoperta della capacità catalitica degli RNA ha aperto nuovi campi di indagine e ha introdotto una serie di informazioni di fondamentale importanza per la biologia evoluzionistica.

Possibili applicazioni delle conoscenze sugli enzimi. - Un campo di ricerca i cui sviluppi potrebbero portare a interessanti impieghi terapeutici è quello degli anticorpi diretti contro lo stato di transizione del substrato, dotati, però, di attività catalitica (quindi enzimatica). Poiché gli anticorpi si legano in maniera specifica a quegli antigeni che ne stimolano la sintesi, è possibile ottenere anticorpi in possesso di attività enzimatica usando come antigeni gli analoghi dello stato di transizione dei substrati.

A tale scopo, immunizzando topi mediante somministrazione di un analogo dello stato di transizione di un substrato delle esterasi (e. che idrolizzano il legame estere), sono stati ottenuti anticorpi monoclonali capaci di indurre la scissione idrolitica del legame estere a una velocità 1000 volte superiore a quella della sua idrolisi spontanea. Il valore del rapporto kcat/K_m uguale a 1.4 × 10⁴M⁻¹s⁻¹, le caratteristiche cinetiche rispondenti all'equazione di Michaelis-Menten e l'inibizione competitiva indotta dagli analoghi del substrato hanno permesso di stabilire con certezza che gli anticorpi così prodotti si comportano come gli enzimi. Uno degli scopi che questo tipo di ricerche si propone è quello di produrre anticorpi in grado di catalizzare reazioni che gli e. ''naturali'' normalmente non catalizzano. Per es., potrebbero essere ottenuti anticorpi capaci di idrolizzare proteine specifiche di virus o di cellule tumorali, che potrebbero perciò risultare di notevole utilità terapeutica.

Bibl.: L. Stryer, Biochimica, Bologna 1989; J.D. Rawn, Biochimica, Milano 1990.