northern blot

northern blot

Una delle procedure più usate dai biologi molecolari per studiare l’espressione di uno specifico gene. Questa tecnica, inventata nel 1977 da James Alwine, David Kemp e George Stark dell’Università di Stanford, deriva il suo nome, per un gioco di parole, da quello del southern blot, tecnica parzialmente simile inventata dallo scienziato britannico Edwin Southern nel 1975. A differenza del southern blot, sviluppato per analizzare frammenti specifici di DNA, il northern blot permette di analizzare qualitativamente e quantitativamente la presenza di specifiche molecole di RNA nell’insieme degli RNA di una cellula o di un organismo. Questa tecnica consente, quindi, di determinare il livello di espressione di un gene misurando l’accumulo di RNA messaggero da questo codificato. La procedura si articola in tre fasi successive. Inizialmente le molecole di RNA estratte da diversi campioni biologici sono separate in base alla loro grandezza tramite elettroforesi in gel di agarosio, in presenza di formaldeide. La formaldeide denatura le molecole degli RNA, srotolandone completamente la struttura secondaria, e facendo così in modo che abbiano una velocità di migrazione elettroforetica proporzionale alla loro grandezza. A questo punto è possibile evidenziare, tramite colorazione con bromuro di etidio, le specie molecolari più abbondanti. Gli RNA ribosomiali, che complessivamente rappresentano più del 98% degli RNA totali, appaiono come bande colorate, ma non è possibile distinguere le singole specie di RNA messaggero. Gli RNA sono poi trasferiti quantitativamente dal gel a un filtro delle stesse dimensioni del gel, mediante assorbimento capillare, ottenendo così una replica del gel sul filtro. I filtri sono in genere di nitrocellulosa (ma si usano anche altri materiali) e le molecole di RNA, dopo il trasferimento, sono fissate covalentemente a essi per mezzo di irradiamento con luce ultravioletta. Infine, l’ultima fase consiste nell’evidenziare sul filtro le molecole della specie di RNA che si desidera studiare. A questo scopo si sfrutta la proprietà delle molecole di acido nucleico di appaiarsi con molecole che hanno una sequenza a esse complementare. Una molecola di DNA o RNA complementare all’RNA che si desidera studiare (RNA bersaglio) è marcata radioattivamente e utilizzata come sonda in una reazione di ibridazione sul filtro. Dopo la reazione di ibridazione, il filtro viene lavato per eliminare l’eccesso di sonda radioattiva che non ha reagito, e quindi esposto a una lastra fotografica al buio. Dopo aver sviluppato la lastra, le molecole della sonda che hanno ibridato con l’RNA bersaglio presente sul filtro formeranno sulla lastra fotografica una banda scura che ne evidenzierà la posizione e la cui intensità sarà proporzionale alla quantità di RNA bersaglio.

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