Topi transgenici e topi knock out come modelli di immunodeficienza
Topi transgenici e topi knock out come modelli di immunodeficienza
II sistema immunitario comprende una rete complessa di diversi tipi cellulari che comunicano fra loro tramite un vasto numero di citochine e chemochine diverse. Un'alterata regolazione di questa risposta integrata o la disfunzione di un particolare aspetto della risposta stessa determinano una risposta immunitaria inappropriata e una immunodeficienza. La capacità di manipolare il genoma murino, mediante l'espressione ectopica di geni o tramite la produzione di mutanti con deficienze congenite predeterminate, ha permesso alla ricerca immunologica di generare modelli murini che riproducono alcune condizioni patologiche di immunodeficienza note nella specie umana. Pur essendo di fondamentale importanza, l'impiego di topi transgenici con geni knock out presenta limiti che vanno tenuti in debito conto nell'interpretazione delle informazioni fornite.
Aspetti interattivi del sistema immunitario
Il sistema immunitario comprende essenzialmente due tipi di linfociti responsabili della risposta immunitaria specifica per l'antigene: i linfociti B, che legano l'antigene intatto e maturano fino a produrre anticorpi ad alta affinità, e i linfociti T, che riconoscono invece frammenti di antigene sulla superficie cellulare. Questi ultimi derivano dal processamento dell'antigene intatto e dalla presentazione dei frammenti peptidici legati all'interno di opportune tasche presenti nelle molecole MHC (Major Histocompatibility Complex, complesso maggiore di istocompatibilità) di classe Iodi classe II.
l fagociti includono nel loro citoplasma e distruggono cellule infettate o microrganismi. Questi eventi nel loro insieme sono complessivamente definiti con l'espressione risposta immunitaria naturale.
Un aspetto fondamentale della risposta cellulare consiste nel fatto che le varie componenti cellulari del sistema immunitario non agiscono in modo indipendente l'una dall'altra. Infatti, le cellule che presentano l'antigene (APC, Antigen Presenting Cells), come i macrofagi, le cellule dendritiche e i linfociti B, interagiscono con le cellule T adiuvanti o helper (TH). Le citochine prodotte dalle cellule TH determinano l'attivazione di programmi funzionali specifici nelle cellule B, nelle cellule T citotossiche e nei fagociti. Data l'importanza di questa rete interattiva di cellule immunitarie, il blocco di una sua parte qualsiasi si risolverà probabilmente in un'immunodeficienza, i cui sintomi possono essere così complessi da non dare un'indicazione evidente della lesione originaria. Anche quando il difetto genetico che provoca l'immunodeficienza osservata nell'uomo sia stato identificato, possono insorgere problemi nell'esame della disfunzione immunitaria che può risultare difficile da studiare per la difficoltà di reperire i tessuti adatti. La possibilità di manipolare il genoma murino, mediante espressione ectopica di un prodotto genico o attraverso l'induzione di mutazioni mirate, offre un mezzo per superare i limiti sopra descritti.
I principi della produzione di topi transgenici e della mutazione genica mirata
I principi della produzione di animali transgenici e della mutazione genica mirata (gene targeting) sono illustrati nella figura (fig. 1). La produzione di animali transgenici implica l'iniezione diretta di un frammento di DNA contenente il gene cui si è interessati, munito degli elementi regolatori appropriati, nel pronucleo maschile di una cellula uovo fertilizzata. L'integrazione del DNA iniettato nel genoma, in genere sotto forma di lunghe ripetizioni del gene di interesse dette concatameri, avviene a caso. L'espressione del transgene è spesso influenzata dalla cromatina circostante; a seconda del sito di integrazione e quindi della posizione che il transgene ha assunto nel genoma, è possibile che il transgene stesso sia espresso inappropriatamente o inattivato. È quindi importante analizzare molte linee progenitrici per evitare potenziali artefatti dovuti a effetti di posizione.
La tecnologia della mutazione genica mirata prevede l'introduzione di mutazioni nel genoma di cellule embrionali staminali (ES, Embryonic Stem). Le cellule ES che portano la mutazione mirata sono introdotte in blastocisti per generare topi chimerici. Se le cellule ES contribuiscono alla produzione di cellule germinali, la mutazione introdotta verrà trasmessa alle generazioni successive dove sarà possibile studiare la progenie omozigote o eterozigote.
Gli immunologi sono stati tra i primi scienziati a riconoscere le grandi potenzialità delle tecniche offerte dagli animali transgenici e dalla mutazione genica mirata. l primi topi transgenici prodotti esprimevano geni riarrangiati del TCR (T Cell Receptor, recettore delle cellule T) o delle immunoglobuline (lg). Questi topi hanno fornito molte informazioni preziose sui processi di esclusione allelica, tolleranza immunologica e restrizione MHC. La mutazione genica mirata è risultata un approccio ancora più potente. Una delle prime mutazioni mirate di un locus tramesso alla linea germinale è stata quella nel gene della microglobulina β2, che codifica una delle subunità degli antigeni MHC di classe I. Nelle tabelle (tab. I) sono indicati alcuni esempi di geni coinvolti nel sistema immunitario studiati mediante mutazione genica mirata.
Questi geni rientrano in categorie funzionali molteplici e i topi con un difetto nell'espressione di tali geni sono stati di inestimabile valore per la comprensione del funzionamento del sistema immunitario. Ovviamente, è impossibile discutere in dettaglio il fenotipo di ciascuno di tali topi mutanti. Piuttosto, saranno illustrati i principi e la validità di tale tecnologia per lo studio della disfunzione immunitaria, facendo riferimento ad alcuni esempi chiave. Questo esame si limiterà essenzialmente alla linea dei linfociti T, allo scopo di dimostrare l'utilità di tale approccio nell'indagine sulle caratteristiche biologiche di una linea cellulare dallo sviluppo complesso.
Sviluppo della serie linfoide
Sviluppo dei linfociti T
Le tappe che conducono al differenziamento delle numerose sottopopolazioni di linfociti a partire da una cellula staminale totipotente sono riassunte nella figura (fig. 2). Come si vede, le fasi di questo processo di sviluppo sono numerose: il loro studio analitico ha rappresentato per decenni un obiettivo fondamentale per gli immunologi, ma di difficile soluzione per la scarsità di modelli sperimentali accessibili. In questo campo, lo sviluppo degli animali transgenici ha rappresentato una vera e propria rivoluzione.
Usando topi ottenuti mediante mutazioni geniche mirate e topi transgenici è stata stabilita l'importanza di un certo numero di geni coinvolti nella regolazione dello sviluppo delle cellule T. La generazione di topi mutanti privi di subunità del TCR ha sottolineato l'importanza di questo recettore in due stadi centrali dello sviluppo. Il TCR è un complesso che comprende le catene α e β, specifiche per ogni clone linfocitario, e il modulo per la trasduzione del segnale CD3 (Cluster of Differentiation, gruppo di differenziamento dei linfociti T3 maturi), costituito dalle catene γ, δ, ε e ζ ed espresso sulla superficie della maggior parte dei timo citi e delle cellule T del sangue periferico. Una forma alternativa del TCR, espressa sulle cellule pre-T, è costituita dalla catena TCRβ e dai polipeptidi CD3 insieme a un polipeptide aggiuntivo denominato pre-Tα. In topi privi del gene TCRβ, dei geni CD3 ε o ζ, oppure del gene pre- Tα, il passaggio da timo citi CD4-8-, doppi negativi (DN, Double Negative), a CD4+S+, doppi positivi (DP, Double Positive), è difettoso. Il passaggio da timo citi DN a timociti DP è bloccato anche nei topi privi dell'attivatore di ricombinazione RAG (Recombination Activating Gene, gene attivante la ricombinazione), incapaci di esprimere le proteine RAG-l o RAG-2, cioè i componenti dell'apparato di ricombinazione specifici per la linea. Al contrario, i timo citi di topi nei quali è difettosa l'espressione dei geni che codificano la catena TCRa o le molecole MHC di classe I o Il, si bloccano allo stadio di timo citi DP e non riescono a diventare timo citi maturi CD4+8- o CD4-8+, singoli positivi (SP, Single Positive). L'analisi di tali mutanti dimostra brillantemente che le due isoforme del TCR controllano stadi distinti dello sviluppo dei timociti. Il pre- TCR guida il passaggio da timo citi DN a DP e il TCRα/β controlla la maturazione da DP a SP (v. figura 2).
L'analisi di topi transgenici che esprimono un TCR clonato è stata di fondamentale importanza nell'organizzare le nostre conoscenze sulla maturazione da timociti DP a timo citi SP. Sebbene siano stati descritti più modelli di topi transgenici per il TCR, tuttavia si possono riassumere, in modo immediato, i principi e l'efficacia di questo approccio facendo riferimento a uno solo di tali modelli: il topo transgenico TCR H-Y. Il TCR utilizzato in questo studio riconosce un peptide che deriva dal processamento dell'antigene H-Y, unamolecola presente solo sulle cellule maschili. Grazie a questo sistema, si possono confrontare le risposte immunitarie in topi maschi e femmine che, per la restante parte del genoma, sono identici. Quando il TCR H - Y viene espresso nel timo di un topo maschio il cui MHC sia compatibile (H2Kb), sia cioè in grado di presentare efficacemente il peptide ai linfociti che esprimono il TCR corrispondente, i timociti vengono eliminati. Questo processo di eliminazione o delezione, denominato selezione negativa, è un meccanismo importante per stabilire la tolleranza immunologica. Con questo sistema sperimentale è stato possibile mimare la situazione normalmente incontrata nello sviluppo linfocitario, e cioè la generazione di un clone che reagisce contro un componente self L'ovvio vantaggio del topo transgenico è che in esso tutti, o quasi tutti, i linfociti esprimono esattamente quel particolare recettore, e non una minima frazione di essi.
Ma cosa accade quando il TCR H- Y è espresso in un topo femmina, dove l'antigene contro cui è diretto non è presente? Anche nei topi femmina, i timociti che esprimono il TCR sono selezionati mediante interazione con la molecola H2Kb, probabilmente legata a un peptide o a peptidi che presentano reattività crociata con l'antigene H-Y. In questo caso, però, si ha selezione positiva. Non essendo autoreattivo, ma in grado di legarsi, probabilmente con bassa affinità, a molecole MHC, il clone viene considerato 'potenzialmente' utile dal sistema, e si espande.
La combinazione di esperimenti con topi transgenici e knock out (in cui uno o più geni sono stati deleti) ha permesso di estendere questi studi pionieristici. In esperimenti brillanti che hanno utilizzato incroci di topi transgenici con topi knock out per gli stessi alleli, due gruppi di ricercatori hanno indicato che la selezione positiva avviene probabilmente quando il TCR mostra un'affinità intermedia per il ligando MHC-peptide (Bevan et al., 1994). La strategia alla base di questi esperimenti utilizza mutanti di topo con un'espressione carente delle molecole MHC di classe I. Uno di tali mutanti è privo di un componente del sistema di trasporto dei peptidi TAP (Transporter Associated with antigen Processing, trasportatore associato al processamento dell'antigene) e l'altro è privo di microglobulina β2. Si può comunque ottenere una certa espressione delle molecole MHC di classe I aggiungendo a colture di timo fetale peptidi contenenti sequenze molecolari ricorrenti che legano le molecole di classe I. In questi sistemi, peptidi ad alta affinità, che agiscono come antagonisti quando sono presentati alle cellule T del sangue periferico che esprimono il TCR appropriato, causano selezione negativa, mentre peptidi a minore affinità causano selezione positiva. È su questo equilibrio delicato tra selezione positiva e selezione negativa che si forgia il nostro sistema immunitario.
l geni delle citochine e dei recettori delle citochine svolgono un ruolo importante negli eventi di sopravvivenza, di proliferazione e di maturazione associati allo sviluppo linfoide. La tecnologia dei topi knock out ha contribuito in modo fondamentale alla nostra conoscenza sulle funzioni delle citochine e dei loro recettori, facendo emergere o escludendo ruoli essenziali e non ridondanti per molte di queste molecole. In questo saggio riassumerò numerosi studi fondamentali facendo riferimento a due recettori che fanno parte della stessa superfamiglia: il recettore dell'interleuchina-2 (IL-2) e quello di lL-7, denominati lL-2R e lL-7R. l topi con un'espressione deficitaria del gene lL- 2Rα o β non mostrano difetti evidenti nello sviluppo dei timociti, ma presentano anomalie nelle cellule T del sangue periferico (Suzuki et al., 1995; Willerford et al., 1995). Al contrario, topi in cui è assente l'espressione del gene lL-7Rα presentano un grave blocco nelle fasi iniziali dello sviluppo dei timociti; il numero dei timo citi è ridotto di 10 ÷ 100 volte e la maggior parte di essi è allo stadio di cellule DN precoci (Peschon et al., 1994). Topi in cui è assente l'espressione della catena y, condivisa da lL-2R e da lL-7R e che rappresenta una molecola-chiave nella trasduzione del segnale di questa famiglia di recettori, presentano un numero ridotto di timociti ma non di sottopopolazioni di timociti DP o SP (Disanto et al., 1995). Questi dati dimostrano chiaramente come il recettore per lL-7 eserciti un ruolo essenziale nello sviluppo dei timociti. Con questi esperimenti non è stato possibile stabilire il ruolo, sempre che ne abbia uno, del recettore per lL-2 nello sviluppo dei timociti, mentre appare chiara la funzione di questa molecola nelle fasi tardive, extratimiche, del differenziamento T -linfocitario (v. oltre).
Le molecole di superficie che guidano qualunque processo di sviluppo sono collegate al nucleo per mezzo di una cascata di trasduzione di segnali citoplasmatici. Le molecole deputate alla trasmissione del segnale sono state oggetto di numerosi studi basati su sistemi di mutazione genica mirata e su animali transgenici. Tali approcci hanno stabilito l'importanza, nello sviluppo dei timociti, di alcuni componenti intermedi di trasduzione del segnale tra cui le proteine tirosinchinasi PTK (Protein Tirosin Kinase), p56lck e ZAP-70 (Z Associated Protein, proteina associata alla catena Z). L'espressione nel timo di molecole p56lck dominanti negativi, in grado cioè di interferire negativamente anche sulle molecole normalmente presenti nella cellula, produce un blocco a livello dello stadio di sviluppo DN (Anderson et al., 1994). Un risultato analogo si ottiene con topi in cui è nulla l'espressione di p56lck, sebbene l'arresto dello sviluppo sia solo parziale. Al contrario, l'espressione nel timo di un transgene costitutivamente attivo produce non solo l'inibizione del riarrangiamento della catena TCRβ, ma anche un blocco dello sviluppo a livello del punto di controllo della via di maturazione dei timo citi DP (Anderson et al., 1994). Nel loro insieme, questi esperimenti sottolineano l'importanza di p56lck negli stadi iniziali dello sviluppo dei timociti, come sensore di segnali mediati dal pre- TCR. Esperimenti con topi knock out hanno anche permesso di comprendere il ruolo centrale della proteina tirosinchinasi ZAP-70 nella progressione attraverso il punto di controllo della maturazione dei timo citi DP. l topi in cui è assente l'espressione di ZAP-70 sono caratterizzati da una selezione difettosa, sia positiva che negativa (Negishi et al., 1995). Quindi, in questo stadio di sviluppo le tirosinchinasi agiscono come sensori dei segnali mediati dai recettori per l'antigene. Infine, si deve spiegare la regolazione dello sviluppo di una linea di cellule in base ai cambiamenti dei profili di espressione genica che si verificano. La tecnologia dei topi transgenici è stata infatti utile per identificare diversi fattori di trascrizione importanti durante la selezione timica. Due esempi che illustrano questo approccio sono rappresentati dagli esperimenti di mutazione genica mirata che coinvolgono Ikaros e TCF-l (T Cell specific transcription Factor, fattore di trascrizione specifico per le cellule T). Nei mutanti con deficit di lkaros sono assenti i linfociti B e T (Georgopoulos et al., 1994), dimostrando così che questo fattore di trascrizione dalla caratteristica struttura elica-anello-elica è essenziale per lo sviluppo linfoide. In modo analogo, TCF -l, un componente della famiglia di fattori trascrizionali HMG (High Mobility Group) è essenziale per la proliferazione dei timo citi DN tardivi (Verbeek et al., 1995).
Gli esempi citati illustrano la grande validità della tecnologia dei topi transgenici nello studio delle immunodeficienze primarie che hanno origine da difetti nello sviluppo dei timociti. Alcuni di questi topi sono anche risultati utili come modelli delle immunodeficienze periferiche. Qui di seguito sono descritti alcuni esempi che illustrano la validità e le potenzialità di tali studi.
Topi con attivazione linfocitaria difettosa
Topi con deficit di IL-2R
lL-2R è il principale recettore di fattori di crescita delle cellule T del sangue circolante. L'interazione di lL-2 con lL-2R è necessaria per la progressione ordinata del ciclo cellulare di una cellula T attivata. Esistono due tipi di recettore per IL-2, uno ad alta e uno a bassa affinità. Il primo è costituito da tre catene polipeptidiche, IL-2Rα, β e γ. IL-2Rγ è una catena comune, condivisa da diversi componenti della famiglia dei recettori delle citochine tra cui IL-4R e IL-7R. Questo gene sembra quindi essere un modulo importante per la trasduzione del segnale, sfruttato sia dalle cellule B che dalle cellule T. In tutti i casi in cui uno dei tre geni che codificano IL-2R è stato deleto, i mutanti knock out hanno prodotto un interessante fenotipo di immunodeficienza.
I topi privi di IL-2Ry hanno un numero di timo citi marcatamente ridotto ma presentano rapporti normali tra le varie sottopopolazioni, suggerendo che in questi topi manchi un'adeguata proliferazione (Disanto et al., 1995). Nel sangue periferico il numero di cellule T è ridotto e anche la loro attivazione è difettosa. Questo mutante di topo riproduce parzialmente la mutazione della catena IL-2Ry nell'uomo (Noguchi et al., 1993), causa della sindrome da immunodeficienza grave combinata legata al cromosoma X (X linked SCID, Severe Combined lmmunodeficiency Disease).
Contrariamente alla situazione descritta per il gene lL- 2R γ, mutazioni che comportano la mancata espressione dei geni lL-2Rα e lL-2Rβ non producono difetti nello sviluppo delle cellule T. Queste mutazioni causano però difetti nella funzione delle cellule T del sangue periferico, per cui ne può derivare una malattia linfoproliferativa. Un aspetto interessante consiste nell'osservazione che questi topi hanno permesso di comprendere il ruolo di IL-2R nell'indurre l'apoptosi dei linfociti T attivati. Infatti, topi privi della catena IL-2Rα presentano un'espansione di linfociti T e B policlonali che, per le cellule T, è correlata a un decremento in vivo della morte cellulare indotta dall' attivazione (Willerford et al., 1995). Tra i topi privi di IL-2Rα i più vecchi sviluppano malattie autoimmuni. Un fenotipo molto simile è stato riscontrato anche in topi privi di IL-2Rβ (Suzuki et al., 1995). In questi topi si è osservato che le cellule T erano attivate spontaneamente e che nel siero erano presenti alte concentrazioni di autoanticorpi, causa di anemia emolitica. Questi risultati dimostrano che IL-2R ha un ruolo importante nel mantenere l'omeostasi e nel prevenire l'autoimmunità.
Topi con deficit di CD40 e del ligando di CD40
Il CD40 agisce come molecola costimolatrice delle cellule B, incrementando la loro sopravvivenza e svolgendo un ruolo importante nella loro crescita e in numerose tappe differenziative. CD40 fa parte di una famiglia di recettori che comprendono il recettore per il TNF (Tumor Necrosis Factor, fattore di necrosi tumorale) e il recettore per l'NGF (Nerve Growth Factor, fattore di crescita nervosa), ed è espresso sulla superficie di tutti i linfociti B maturi. Il ligando di CD40 (CD40L) appartiene alla stessa famiglia ed è espresso in modo transitorio dalle cellule T helper CD4+ attivate. In conformità con il ruolo costimolatore di questa molecola, nei topi con deficit di CD40 le cellule B non sono in grado di proliferare e di effettuare lo switch isotipico, cioè la commutazione di classe delle immunoglobuline, né di stimolare una risposta immunitaria contro antigeni dipendenti dalle cellule T (Castigli et al., 1994). Le cellule B di questi topi rispondono però normalmente agli antigeni indipendenti dalle cellule T. La mancata espressione del CD40L sulle cellule T determina una produzione ridotta di IgM e una mancata produzione di IgG l in risposta a un antigene timo-dipendente; tuttavia questi topi rispondono normalmente agli antigeni indipendenti da T (Xu et al., 1994). Il fenotipo di questi mutanti riproduce quello dell'immunodeficienza umana legata al cromosoma X caratterizzata da infezioni batteriche ricorrenti, da livelli sierici di IgG, IgA e IgE bassi o assenti e da un aumento dei livelli di IgM e IgD. È stato dimostrato che questa immunodeficienza è causata da mutazioni punti formi nel gene che codifica CD40L che ne determinano un'espressione difettosa sulle cellule T (Korthauer et al., 1993). L'osservazione che deficienze coinvolgenti sia il recettore sia il ligando portano a situazioni patologiche simili testimonia il ruolo centrale di questa interazione nello sviluppo dei linfociti B.
Topi con deficit di ZAP-70
La proteina ZAP-70 è una tirosinchinasi citoplasmatica coinvolta nella trasduzione del segnale attraverso il TCR, che si associa specificamente con la catena ξ del complesso recettoriale. Come definito precedentemente, questa PTK è essenziale per la selezione dei timociti, sia positiva che negativa, dato che tutti e due i processi sono difettosi in topi mancanti del gene ZAP-70 su entrambi i cromosomi e perciò noti come ZAP-70-/- (Negishi et al., 1995). Di conseguenza, i topi privi di ZAP-70 non hanno cellule T CD4+ o CD8+ nel sangue periferico. Una rara sindrome dell'uomo, l'immunodeficienza grave combinata (SCID), è associata a mutazioni nel gene ZAP-70 (Arpaia et al., 1994). Coloro che sono colpiti da questa malattia, pur essendo privi di cellule T CD8 nel sangue periferico, hanno però un numero normale di cellule TCD4 non funzionali. Questa differenza tra topi e uomini è ancora senza spiegazione, anche se è possibile avanzare almeno due ipotesi. Innanzitutto, può darsi che la proteina Syk, l'altro membro conosciuto di questa famiglia di PTK, abbia una capacità diversa di compensare la mancanza di ZAP-70 nell'uomo e nel topo. Alternativamente, le mutazioni umane potrebbero produrre un fenotipo in cui l'espressione non è completamente assente. Entrambe queste possibilità sono elementi potenziali di confusione nell'interpretazione del fenotipo di un topo knock out e nella definizione della sua rilevanza come modello della malattia genetica umana.
Topi con defict di Jak-3
Jak-3 è un membro della famiglia delle tirosinchinasi Janus, la cui espressione è limitata ai tessuti ematopoietici. È stato dimostrato che la proteina Jak-3 e la proteina Jak-l sono coinvolte nella trasduzione del segnale attraverso la famiglia dei recettori delle citochine, i cui membri usano tutti la catena IL-2Ry. Topi con espressione difettosa di Jak-3 presentano un grave blocco nello sviluppo delle cellule B allo stadio di cellule pre-B (Thomis et al., 1995). Anche il numero di timo citi e cellule T è molto ridotto, sebbene siano chiaramente presenti nel sangue periferico le popolazioni più mature di timo citi e le cellule T. Ciononostante, le cellule T periferiche prive di Jak-3 sono funzionalmente difettose, perché incapaci di proliferare in risposta a segnali mito genetici. Anche in questo caso è stata identificata una patologia umana che sembra corrispondere alla situazione generata nei topi privi di Jak-3. Un gruppo di pazienti affetti da SCID autosomica ha infatti mutazioni nel gene Jak-3 (Russell et al., 1995). Questi pazienti presentano mutazioni o delezioni che portano a livelli marcatamente ridotti di tale proteina. Gli individui privi di Jak-3 manifestano un fenotipo molto simile a quello dei topi Jak-3-/- come pure a quello di topi e di uomini privi della catena γ, comune a tutti i componenti di questa famiglia di recettori. Questo gruppo di topi mutanti non solo consente di analizzare i meccanismi alla base delle SCID umane, ma fornisce anche i mezzi per sperimentare strategie di terapia genica ancor prima degli studi clinici.
Sviluppo delle cellule TH1 e TH2
Le cellule T CD4 mature rientrano in due gruppi fondamentali che, da un punto di vista funzionale, sono definiti in base allo spettro di citochine che sintetizzano (v. figura 2). Le cellule THl sintetizzano IL-2, IFN-γ (interferone γ) e TNF-β, mentre le cellule TH2 secernono IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. Sempre da un punto di vista funzionale, le cellule T H l interagiscono in modo preferenziale con le cellule fagocitarie, mentre quelle TH2 promuovono la proliferazione e il differenziamento delle cellule B. Si ritiene che il differenziamento delle cellule THl e TH2 a partire da un putativo precursore comune, come una cellula T vergine che non ha ancora risposto all'antigene, sia controllato, almeno in parte, dal tipo di citochine con cui vengono a contatto. In particolare, sono critici i livelli relativi di IL-4 e IL-12 al momento della stimolazione primaria di cellule T vergini, dato che queste due citochine sono essenziali per indirizzare le cellule rispettivamente lungo la via TH2 (IL-4) e lungo la via THl (IL-12).
L'importanza di IL-4 nel differenziamento delle cellule THl o TH2 è stabilita dal fenotipo di topi con un'espressione difettosa di IL-4 (Kopf et al., 1993). Le cellule T CD4+ di topi IL-4-/-, dopo stimolazione, sono incapaci di produrre citochine di derivazione T H2 e mostrano risposte ridotte all'infezione da parte dei nematodi, che normalmente induce un'attivazione selettiva delle cellule TH2. Questi esperimenti dimostrano che IL-4 è necessaria per la produzione di citochine di derivazione TH2 e che le risposte immunitarie dipendenti da questa citochina risultano difettose in topi knock out.
La famiglia dei recettori delle citochine, di cui fa parte IL-4R, trasmette segnali all'interno dei linfociti attraverso la via Jak/Stat di trasduzione del segnale. Le proteine Stat (Signal transduction and activation of transcription, fattori di trasduzione del segnale e attivazione della trascrizione) sono una famiglia di fattori trascrizionali che, presenti in una forma inattiva nel citoplasma, vengono fosforilati dalle chinasi Jak in seguito all'interazione citochina-recettore. Una volta fosforilate, sotto forma di dimeri, le proteine Stat traslocano nel nucleo dove attivano i geni bersaglio. La proteina Stat 6 è attivata specificamente in risposta a IL-4. Il ruolo essenziale di Stat 6 nella trasduzione del segnale mediata da IL-4R è dimostrato dall'analisi di topi privi di Stat 6 (Takeda et al., 1996). In vivo, anche dopo stimolazione con agenti che attivano selettivamente una risposta immunitaria di tipo TH2, le risposte IgE e IgG l sono, infatti, assenti e si ha una mancata produzione di citochine TH2. Questa strategia ha anche stabilito l'importanza delle citochine specifiche e delle molecole di trasduzione del segnale per la via THl. Infatti, nei topi con deficit di IL-12 sono difettose sia la produzione di IFN-γ sia la capacità di sviluppare risposte DTH (Delayed Type Hypersensitivity, ipersensibilità di tipo ritardato) in cui i linfociti T attivati dall'antigene producono citochine (Magram et al., 1996). Ciononostante, altre risposte THl, come la generazione e la proliferazione dei linfociti citotossici nonché la secrezione di IL-2 e IL-10 dopo stimolazione antigenica, appaiono normali. Anche la mutazione di Stat 4, la proteina attivata in risposta a IL-12, influisce sulla via THl. In topi privi di Stat 4, la risposta T H l è assente (Thierfelder et al., 1996). Questi topi non presentano un incremento dell'espressione di IFN-γ e non sviluppano una risposta THl dopo stimolazione con IL-12 o con l'antigene, mentre sono caratterizzati da un aumento della risposta TH2.
Topi transgenici e topi knock out come modelli della sindrome infiammatoria intestinale
Come già ricordato, la caratterizzazione del TCR e di topi privi di citochine ha consentito di approfondire notevolmente le nostre conoscenze sullo sviluppo e sulla funzione dei linfociti. Tuttavia, l'analisi di questi topi ha portato a una scoperta assolutamente inattesa: le lesioni intestinali che essi sviluppavano erano simili a quelle che nell 'uomo vengono defrnite come sindrome infiammatoria intestinale (IBD, Inflammatory Bowel Disease). Un'infiammazione intestinale cronica si presenta infatti con frequenza elevata in mutanti TCRα-/-, TCRβ-/- e TCR(βxδ)-/- mantenuti in specifiche condizioni di assenza di patogeni, e anche in topi in cui sono stati distrutti in modo mirato i geni di alcune citochine, tra cui IL-2, IL-10 e TGF-β (Powrie, 1995). Al contrario, topi in cui è assente l'espressione del gene RAG; non manifestano colite. L'analisi di incroci di topi RAG-2-/- con topi JH-/- ha dimostrato che le cellule T, ma non le cellule B, sono necessarie per sviluppare la colite in topi privi di IL-2 (Ma et al., 1995). In tutti questi topi, le malattie di tipo colitico possono essere spiegate dal fatto che manca una popolazione di cellule T αβ regolatrici che normalmente impedisce lo sviluppo di risposte immunitarie contro antigeni presenti nell'intestino. Secondo questa ipotesi, nei topi con deficit di TCR o di citochine, i microbi patogeni generano una risposta non soggetta a regolazione che porta a un'infiammazione cronica con i sintomi della colite. L'importanza dei microbi patogeni in questo processo è stata dimostrata osservando che, in condizioni sterili, colonie di topi privi di IL- 2 o IL-10 non sviluppano la colite (Powrie, 1995).
Una questione centrale è quella di individuare modelli animali per lo studio della malattia umana. Tra le due forme principali di IBD umana, come la colite ulcerosa e il morbo di Crohn, e la colite osservata in topi privi del TCR e di citochine, si riscontrano parecchie differenze. In particolare, dato che la colite osservata nei topi knock out sembra dipendere dall'infezione microbica, tali topi potrebbero essere modelli più adatti per rispecchiare la malattia infiammatoria intestinale comunemente riscontrata in pazienti con una globale immunosoppressione, come i malati di AIDS, rispetto ai modelli di IBD, considerata da molti un processo in gran parte autoimmunitario. Ovviamente, queste considerazioni sono di fondamentale importanza quando si usano i modelli murini al fine di verificare le potenzialità di cure e diete per il miglioramento della malattia umana.
Limiti e problemi nella generazione di topi transgenici
La tecnologia dei topi transgenici è stata estremamente importante per lo studio dello sviluppo e delle funzioni del sistema linfoide e ha fornito modelli di immunodeficienza di valore enorme. Ciononostante, alla generazione di topi transgenici sono associati problemi e limiti che devono essere tenuti in considerazione quando si interpretano i fenotipi osservati. Alcuni di tali problemi sono elencati nella tabella (tab. 2). Quelli comunemente associati all'espressione di transgeni nei topi riguardano la scelta degli elementi regolatori utilizzati per dirigere l'espressione del transgene e gli effetti dovuti alla posizione di integrazione esercitati dalla cromatina circostante. È possibile che i principali elementi di regolazione, come il promotore e l'enhancer che controllano l'espressione del gene, non siano stati ancora caratterizzati con precisione, e che si renda perciò necessario l'impiego di promotori ed enhancer eterologhi. Questo metodo può a sua volta determinare l'espressione del gene in una fase inappropriata dello sviluppo, producendo un fenotipo che in realtà è un artefatto. Gli effetti dovuti alla posizione di integrazione del transgene dipendono dal fatto che la cromatina circostante influenza l'espressione del transgene stesso, producendo a sua volta un'espressione inappropriata e, conseguentemente, un fenotipo diverso in topi fondatori differenti. È possibile superare questo limite utilizzando elementi enhancer contenenti le LCR (Locus Control Regions, regioni di controllo del locus), definite operativamente come sequenze che conferiscono un'espressione dipendente dalla copia del transgene, ma indipendente dalla posizione di integrazione. Entrambi gli enhancer di CD2 e di p56lck possiedono attività LCR e sono spesso utilizzati per esprimere geni nella linea delle cellule T. In alternativa, è possibile indirizzare l'integrazione del transgene nella stessa localizzazione di cromatina in linee diverse di topi capostipiti, utilizzando il sistema crei lox (Fukushige e Sauer, 1992).
La generazione e l'analisi di topi ottenuti mediante mutazione genica mirata sono associate anche ad altri problemi. Talvolta non si riscontra un fenotipo evidente, come per esempio nel caso dei topi privi di CD2. In questi casi si ritiene spesso che il ruolo del gene sia ridondante, cioè uno o più altri geni possono sostituire il gene mutato. Tuttavia, geni veramente ridondanti non sono soggetti alla pressione selettiva; perciò la loro espressione viene persa rapidamente a causa dell'accumulo di mutazioni. È stato calcolato che la possibilità di mantenere l'espressione di CD2, senza che questo sia favorito dalla selezione, da quando ha avuto luogo la divergenza evolutiva tra primati e roditori, è minore di l su 10⁹ (Davis e Van Der Merwe, 1996). Anche se un fenotipo può non essere evidente, talvolta accade che si manifesti con l'avanzare dell'età. Topi giovani privi di lL-2, lL-2Rα e lL-2Rβ, per esempio, sono apparentemente normali, ma invecchiando sviluppano immunopatologie.
Un altro problema riguarda il fatto che la distruzione di un gene può provocare letalità embrionale, un fenotipo inutile per lo studio del sistema immunitario. Per aggirare questo ostacolo, se la letalità embrionale interessa una fase avanzata dell'embriogenesi è possibile usare chimere ottenute dall'innesto di cellule di fegato fetale dell'animale transgenico in topi irradiati, oppure analizzare in vitro lo sviluppo dei timo citi mediante colture di timo fetale. Una strategia alternativa molto interessante implica l'analisi di chimere generate dall'iniezione di cellule ES, che portano la mutazione mirata, in blastocisti di topi con deficit di RAG. Nel topo chimerico che ne risulta, poiché lo sviluppo linfoide in topi carenti di RAG è bloccato allo stadio compreso tra cellule pro- e pre-B o T, tutte le cellule B o T deriveranno dalle cellule ES mutate.
Un'ulteriore complicazione legata all'interpretazione di un fenotipo knock out riguarda la natura esatta della mutazione introdotta. Per esempio, se la mutazione genica mirata comporta l'espressione di un prodotto proteico alterato, essa può generare una forma dominante negativa della proteina. Se il gene appartiene a una famiglia, il mutante dominante negativo può inibire l'attività di altri elementi della famiglia stessa e produrre così un fenotipo più grave. Quindi, è essenziale caratterizzare in modo completo il gene mutato analizzando l'RNA e la proteina corrispondente. Il fenotipo di un topo knock out può anche variare in base al tipo di identità genetica. Perciò, per controllare le differenze fenotipiche, è preferibile incrociare topi fondatori con almeno due ceppi differenti.
Quando si utilizzano topi con mutazioni geni che mirate per determinare la funzione o le funzioni di un gene, è importante considerare se il fenotipo osservato è una conseguenza della mutazione o se la mutazione ha influenzato indirettamente l'espressione di un gene vicino. La strategia impiegata nella maggior parte degli esperimenti di mutazione genica mirata implica l'inserzione di un gene di resistenza a un farmaco dentro un esone controllato da un promotore e da un enhancer adatti. Gli elementi regolatori che dirigono l'espressione del gene esogeno possono interferire con l'espressione di un gene vicino. Per esempio, tre diverse strategie di mutazione genica accomunate dal fatto di recare mutazioni che annullavano l'espressione del gene (Myogenic Factor Gene) che codifica il fattore MRF4 hanno dato origine a fenotipi differenti tra loro (Olson et al., 1996). La variabilità fenotipica dipendeva, almeno in parte, dal fatto che gli elementi regolatori della cassetta di selezione interferivano probabilmente con l'espressione di un gene vicino, il gene Myf5 (Myogenic transcription factor 5, fattore di trascrizione miogenico 5).
La prova migliore che un fenotipo sia dovuto proprio alla mutazione del gene prescelto è la scomparsa del fenotipo stesso in seguito alla riespressione del gene di tipo selvatico. È possibile però, che gli elementi regolatori che controllano l'espressione del gene interessato non siano noti. Come approccio alternativo si possono utilizzare strategie di mutazione genica mirata che portano all'eliminazione di sequenze di DNA estraneo. La più sofisticata di queste tecniche è quella hit and run (letteralmente, colpisci e fuggi) in cui si possono introdurre mutazioni di singole coppie di basi (Hasty et al., 1991). Il sistema cre/lox, che consente un'esatta localizzazione delle sequenze da immettere nel genoma o da rimuovere dal genoma, può essere usato anche per eliminare il gene che conferisce la resistenza ai farmaci, utilizzato per la selezione (Gu et al., 1993). Questi metodi potrebbero presto diventare una pratica di uso comune per fare in modo che gli esperimenti di mutazione genica mirata assicurino a un gene la sua corretta funzione.
Conclusioni
Le tecniche di produzione di animali transgenici e di mutazione genica mirata sono state di fondamentale importanza per lo studio delle funzioni e delle disfunzioni del sistema immunitario. La generazione di modelli murini per descrivere le immunodeficienze umane ha permesso non solo di studiare i meccanismi alla base di una malattia, ma anche di analizzare l'efficienza degli approcci di terapia genica correttiva. È probabile che queste tecniche diventino sempre più importanti dal momento che, tramite i progetti di sequenziamento del genoma umano e murino, sono stati identificati molti nuovi geni coinvolti nella regolazione della risposta immunitaria. Finora, le strategie di mutazione genica mirata si sono risolte, per la maggior parte, nella generazione di un fenotipo nullo. In futuro, una serie di mutanti allelici si dimostrerà probabilmente più valida per determinare la funzione di una proteina. Ciò richiederà un miglioramento della tecnica per aumentare la frequenza e l'accuratezza della mutazione genica. Questi sviluppi produrranno sicuramente un numero molto più grande di modelli di immunodeficienza e permetteranno di identificare l'origine genetica delle malattie umane con eziologia tuttora sconosciuta.
Ringraziamenti
A causa dei limiti imposti al numero di referenze, non è stato possibile citare tutte le pubblicazioni che riportano i progressi descritti in questo articolo. L'autore si scusa con tutti i colleghi il cui lavoro non ha potuto qui ricordare.
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