TERATOGENESI
TERATOGENESI (o embriologia teratologica)
La teratologia (v. vol. XXXIII, p. 543) è lo studio descrittivo delle anomalie dello sviluppo embrionale, le quali determinano la formazione di aberrazioni o malformazioni, che, spinte al massimo grado si denominano mostruosità (terata): si vale dell'osservazione anatomica perfezionata da quella embriologica. Teratogenesi o teratogenia è invece l'analisi della genesi di dette anomalie, l'indagine delle cause che le determinano, la precisazione dello stadio in cui l'agente che provoca la mostruosità o "teratogeno" presumibilmente agisce, lo studio del suo meccanismo di azione, l'applicazione di metodiche varie per produrre sperimentalmente, direttamente o indirettamente, quelle reazioni, d'ordine morfogenetico e fisiologico dell'uovo o dell'embrione, che sono alla base della insorgenza delle malformazioni. La t. adotta pertanto metodi non dissimili da quelli dell'embriologia sperimentale.
Fra i più antichi esperimenti fatti per ottenere malformazioni di sviluppo sono, ormai classici, quelli di C. Dareste (1855-1891) che sottopose le uova di pollo a condizioni anomale di incubazione (aumento di temperatura, raffreddamento, scotimento, ecc.) e descrisse dettagliatamente numerose mostruosità e malformazioni. Seguirono, poi, numerosi, gli esperimenti di altri autori che usarono agenti teratogeni diversi, chimici e fisici (sostanze tossiche, acidi, alcali, corrente elettrica, irradiazioni, centrifugazione ecc.), applicandoli anche su uova di animali acquatici quali Pesci ed Anfibî. Ma l'indagine, fin qui impostata sulla modificazione e alterazione delle condizioni generali di sviluppo, non poteva dare che ragguagli generici, sulle cause prime ed i meccanismi di origine della malformazione. Soltanto alla fine del secolo scorso, con l'inizio della embriologia sperimentale, si attuarono i primi interventi precisi sull'uovo e si adottarono tecniche sperimentali svariate utili a provocare malformazioni e mostruosità.
Questi metodi, cosiddetti "diretti", presero l'avvio dalle fondamentali esperienze di H. Spemann (1901-1903) sull'uovo di Anfibî: un esempio classico è quello della formazione dei mostri doppî in Triton (duplicitas) ottenuti mediante legatura dell'uovo (scoperta nel 1896, dal nostro A. Herlitzka). La spiegazione, fornita dallo Spemann, si dimostrò valida ed applicabile ai mostri doppî di altri Vertebrati e anche di Invertebrati. Tra questi metodi diretti si venne soprattutto affermando quello delle asportazioni o lesioni localizzate sull'uovo e sull'embrione, mediante tecniche microchirurgiche, più avanti realizzate con i più fini micromanipolatori o con altri mezzi atti a colpire e ledere un territorio limitato dell'uovo o dell'embrione, come la puntura elettrolitica, la microraggiopuntura con raggi ultravioletti, le irradiazioni localizzate, principalmente con raggi X, del radio, di varie sostanze radioattive, la radioemanazione, applicate su varie specie di uova (Pesci, Anfibî, Uccelli ed anche Mammiferi).
La tecnica di P. Vintemberger di irradiazione dei blastomeri con raggi X, dell'uovo di Rana, fu perfezionata ed applicata all'embrione di pollo da P. Ancel ed Et. Wolff, nel 1932, realizzando un decisivo progresso. Mediante adatti schermi veniva utilizzato un fascetto cilindrico di raggi X che colpiva, con la stessa intensità, zone esattamente circoscritte del blastoderma di pollo, di dimensioni variabili da 0,05 mm di diametro, a 0,1 mm di larghezza per i mm di lunghezza. L'irradiazione può essere di durata variabile a seconda dell'effetto che si vuole realizzare; l'azione dei raggi X può così colpire localmente determinati territorî o "abbozzi" ancora indifferenziati del blastoderma, o quando il differenziamento è già cominciato. Il risultato è un arresto di sviluppo nel territorio leso e, tacendo d'altro, l'alterato o mancato svolgersi dei movimenti morfogenetici.
Con questo metodo, che il Wolff ha applicato sistematicamente, con minuziosi accorgimenti tecnici e con molta esattezza, su precoci stadî di sviluppo del pollo, si sono potute ottenere con risultati costanti, la maggior parte delle mostruosità e malformazioni che appaiono spontaneamente e realizzarne anche delle nuove. Così in stadî caratteristici (ad es. nell'embrione di 10 a 20 ore di incubazione) si è potuto fissare con esattezza la estensione e localizzazione dei territorî che irradiati producono determinate malformazioni. E. Wolff ha dimostrato, ad esempio, che i mostri cosiddetti "ciclocefali" ad occhio impari e mediano (cilopi pr. detti) si ottengono irradiando, nel blastoderma alla 20ª ora di incubazione, una piccola area circoscritta, anteriore al prolungamento cefalico, limitata sul davanti dal futuro cercine midollare-traverso, quel territorio che corrisponde alla porzione cefalica della piastra midollare; così i varî casi di "simelia" (fusione degli arti posteriori in un arto unico), si ottengono irradiando la regione del "seno romboidale" nello stadio di 15 somiti, regione ai cui lati sono situati gli abbozzi delle zampe. Ledendo perciò con i raggi una piccola regione trapezoidale, inscritta nel seno romboidale, lungo l'abbozzo degli organi assili, gli abbozzi degli arti si fondono medialmente. Analoghi procedimenti, applicati su altri territorî, provocano la simpteria, la onfalocefalia, la diplocardia, ecc.
Nello studio della t. va tenuto conto di due ordini di cause di anomalie e malformazioni, e cioè: i fattori genetici e i fattori ambientali che possono dar luogo agli stessi tipi di anomalia o anche insieme coagire. Di tutta una vasta serie di malformazioni e di anomalie dovute a fattori genetici, che sono ereditarie, si occupa la genetica, nel capitolo delle mutazioni, ma sul meccanismo che porta alla malformazione, qualora anche si tratti di anomalie dipendenti da fattori ambientali, è principalmente dall'indagine morfologica ed embriologica che può scaturire la spiegazione causale dell'effetto teratologico.
Dal punto di vista embriologico, la comparsa di anomalie di sviluppo si può riferire a molteplici cause. Secondo una recente classificazione di E. Zwilling (1955), che qui si riassume, ma che non vuole essere completa e definitiva, tali cause sarebbero: a) l'assenza, deficienza o eccesso dello stimolo induttore; b) la mancata, incompleta o eccessiva reazione del territorio reagente o ostacoli meccanici per l'attuarsi normale della reazione; c) alterazioni di entrambi: stimolo induttore e reazione indotta; d) differenziamento atipico o accrescimento anormale dei costituenti l'abbozzo; e) processi degenerativi, alterazioni e anomalie delle attività funzionali e dei meccanismi regolativi.
Diamo alcuni esempî illustrativi: nell'embrione di pollo il differenziamento del rene (metanefro) risulta subordinato allo stimolo induttore dell'abbozzo dell'uretere; infatti, se con un intervento microchirurgico si impedisce all'abbozzo dell'uretere di raggiungere il blastema metanefrogeno, questo non si differenzia ulteriormente a dare i tubuli renali. Tale correlazione di sviluppo tra abbozzo dell'uretere e metanefro è dimostrata anche da un noto mutante "attero" nei polli (wingless), nei cui omozigoti recessivi il rene, in assenza dell'abbozzo dell'uretere, non si differenzia permanendo allo stadio di blastema. La malformazione di questo mutante è perciò spiegata, nella sua causa, dal risultato dell'esperimento eseguito sull'embrione (Zwilling, 1949).
Un eccesso dello stimolo induttore può portare alle cosiddette "iperinduzioni" o "ipersviluppi", come è il caso della notocorda ingrandita, associata a espansione del rombencefalo, a duplicazione dell'epifisi, ecc. ottenuti da S. Ranzi, E. Tamini e E. S. Offer (1946) nello sviluppo di Anfibî, trattando le blastule con solfocianato ed altre sostanze.
Nei Vertebrati, tutte le malformazioni concatenate a disturbi nei movimenti della gastrulazione, che possono essere provocati dai più svariati agenti chimici e fisici, così come i varî "ipomorfismi", conseguenti a parziale exogastrulazione, la microcefalia e la ciclopia (malformazioni che possono prodursi anche spontaneamente), piuttosto che ad accrescimento anomalo debbono interpretarsi come dovute ad alterata o mancata reazione dei varî territorî embrionali sensibili agli stimoli induttori. Nella già menzionata mutazione "attera" dei polli, le ali, nello sviluppo embrionale, si abbozzano, ma, negli omozigoti (Zwilling, 1949), si constata che l'abbozzo dell'ala manca di un tipico ispessimento ectodermico apicale e l'ala non si sviluppa. Se in un embrione di 72 ore di una comune razza di polli, si asporta il suddetto ispessimento ectodermico, la porzione distale dell'ala non si sviluppa: il meccanismo della malformazione del mutante è perciò, anche in questo caso, chiarito dall'esperimento di embriologia.
Il frapporsi di un ostacolo meccanico nel sistema induttore-reattore, può anche condurre a malformazioni e anomalie di sviluppo: le ben note exogastrule ottenute da J. Holtfreter (1933) sottoponendo le blastule di alcune specie di Anfibî Urodeli, denudate dai loro involucri, all'azione di soluzione fisiologica lievemente ipertonica, mostrano che causa del mancato differenziamento dell'ectoderma in tessuto nervoso è l'assenza del substrato organizzatore, il tetto archenterico, dovuta all'irregolare o mancato approfondimento del materiale endo-mesodermico all'interno del germe, che si compie invece durante la gastrulazione normale.
Analogamente in quei noti mutanti dei topi, caratterizzati da un aberrante tipo di movimenti che li ha fatti giustamente denominare "danzanti" (shakershort mice) e dalla sordità, che sono strettamente legati ad anomalie e aberrante funzionamento dell'orecchio interno, l'indagine embriologica (K. Bonnevie, 1934) ha dimostrato che lo sviluppo dell'orecchio si svolge come di norma fino al 9° giorno di gestazione, ma successivamente la vescicola otica, per mancata regolare espansione del mielencefalo, non riesce a contrarre con esso i normali rapporti di contiguità e di conseguenza non si differenziano le formazioni tipiche del labirinto o queste risultano distorte o rudimentali.
È altrettanto noto che anomalie di sviluppo conseguenti ad alterate condizioni ambientali possono essere provocate da atipico funzionamento dello stimolo induttore associato a una difettosa reazione nel territorio indotto, e per spiegarlo si ricorre a quella componente essenziale della induzione embrionale che è la "competenza" del tessuto reagente.
Un'altra prova di questo fatto, valida per anomalie che hanno base genetica, si può desumere dai risultati di alcuni esperimenti di ibridazione interspecifica, in particolare sugli Anfibî, che sono stati oggetto, per gli Anuri, di un'ampia analisi di G. Montalenti (1938). Più recenti sono alcuni esperimenti del Moore (1946-48); nell'incrocio Rana pipiens × sylvatica, le uova si arrestano nello sviluppo all'inizio della gastrulazione; le gastrule sopravvivono parecchi giorni e poi vanno in citolisi. Controllando con trapianti etero- e xenoplastici, la competenza dell'ectoderma e la capacità induttrice del labbro del blastoporo di tali gastrule ibride su embrioni ospiti normali, e usando come controllo trapianti analoghi di tessuto gastrulare di Rana pipiens, questo autore, è riuscito a dimostrare, in varî lavori, che tanto la competenza del tessuto reagente, quanto lo stimolo induttore erano - negli ibridi - entrambi in difetto. J. Brachet (1947), nelle stesse gastrule ibride bloccate, metteva in chiara evidenza un'inibizione nei processi di sintesi dell'acido ribonucleico. Altrettanto noti i casi di differenziamento anomalo di tessuti in varî abbozzi embrionali: tra quelli più dimostrativi la mesodermizzazione dell'abbozzo presunto della corda in embrioni di Triturus trattati col litio (F. Lehmann, 1938) o la formazione di tessuti tumorali, rappresentati da escrescenze epidermiche, in embrioni di Rana temporaria sviluppati da uova sovrammature (E. Witschi, 1922-1934).
Un'altra fonte di anomalie di sviluppo può derivare da un accrescimento anomalo dell'organismo e delle sue parti costituenti, causa deficienze o eccessi dei varî fattori di crescita.
Anche fenomeni degenerativi dei tessuti, che sono espressione di alterate attività fisiologiche, possono dare origine ad anomalie di sviluppo: così trattando con raggi X o con radioemanazione. gli embrioni di Anfibî e di Uccelli nei varî stadî, dalla blastula alla gastrula o, rispettivamente, della linea primitiva o del prolungamento cefalico (G. Vernoni, 1910; P. Pasquini e G. Meldolesi, 1929-30; P. Pasquini, 1931-32) si ha un quadro di malformazioni (della istogenesi e organogenesi) conseguenti all'azione lesiva delle radiazioni sulle cellule (che diventano incapaci di sintetizzare l'acido desossiribonucleico).
Fenomeni di degenerazione, con distruzione di cellule, possono tuttavia verificarsi normalmente, durante lo sviluppo embrionale, come regolare partecipazione ai processi morfogenetici: tale è il caso dell'abbozzo della regione cloacale e dell'encefalo nell'embrione di pollo, dell'abbozzo dell'arto nell'embrione di topo, tutti casi in cui, in un certo stadio, si manifestano zone localizzate in degenerazione. In certi casi di sviluppo anomalo, per circostanze svariate, il processo degenerativo si estende, invece, oltre i normali limiti, provocando varie malformazioni. Nella mutazione cosiddetta "anura" dei polli o "rumpless" (che è dominante), i varî gradi di riduzione e malformazione della regione caudale, sono conseguenti al fatto che quel focus degenerativo che si osserva nello sviluppo normale in corrispondenza della placca anale (posteriormente al bottone caudale) e che, come è noto, rappresenta un residuo della linea primitiva, partecipando alla formazione della cloaca e dell'ano, non resta limitato alla placca, ma si estende all'abbozzo del bottone caudale, producendo la malformazione.
Questi casi dimostrano che anomalie e mostruosità possono perciò derivare anche da processi degenerativi che fanno deviare la normale morfogenesi; frequentemente si può riscontrare che tali processi possono essere dovuti a incompatibilità genetica, come accade nella merogonia ibrida degli Anfibî, in cui gli embrioni presentano territorî in degenerazione fin da precoci stadî dello sviluppo (F. Baltzer, 1930; E. Hadorn, 1932).
Lo sviluppo teratologico si può ancora riferire ad alterate attività fisiologiche dell'embrione, a difettosi meccanismi regolativi, come possono insorgere ad es. per disquilibrî ormonali. Si conoscono ad es. due mutazioni del topo ottenute con raggi X che sono caratterizzate da una eccessiva produzione di liquido cerebro-spinale da parte dei tessuti coroidei. L'eccesso di tale fluido, in una delle due mutazioni, fuoriesce dall'encefalo e si diffonde sotto la pelle dell'embrione producendo delle vesciche, talora ripiene di coaguli di sangue extravasato. Tali vesciche si distribuiscono specialmente al disopra degli occhi, all'estremità distale degli arti e questi, per cause meccaniche dovute alla pressione delle vesciche, possono dare estremità a clava, casi di sindattilia, di ipodattilia o anche autoamputarsi. Nell'altra mutazione la sovraproduzione del fluido cerebro-spinale accade al 12° giorno di gestazione e il liquido non fuoriesce dall'encefalo: in tal caso si sviluppa un mostro idrocefalo pressoché tipico.
Ben noti effetti di disquilibrî ormonali che provocano deviazioni del normale sviluppo, sono stati descritti da N. W. Fugo (1940) nell'embrione di pollo di 33 a 38 ore di incubazione, sottoposto all'asportazione dell'abbozzo dell'ipofisi. L'accrescimento di questi embrioni è ritardato e inibito, sempre più accentuatamente, dopo il 16° giorno di incubazione. A questa alterazione si associano spiccate anomalie delle penne, della tiroide, nella struttura del testicolo, nell'assorbimento del sacco vitellino, in un quadro che ricorda molto da vicino i ben noti casi ereditarî di disfunzione ipofisaria.
Essenziale nello studio della t. sperimentale è considerare l'estrema variazione di suscettibilità che uova ed embrioni presentano ai varî trattamenti. Così uova fecondate provenienti dalla stessa covata o deposizione, non reagiscono allo stesso modo ad un certo numero di condizioni e altrettanto varia è la frequenza di reazione nella discendenza da genitori diversi. Ciò sta a indicare come alterazioni dello stato fisiologico dei genitori o della loro costituzione genetica, possano essere sorgente di questa variabilità di reazione delle uova agli agenti teratogeni.
Perché lo sviluppo si inizî e si compia normalmente è indispensabile che le uova siano prodotte e mantenute in condizioni normali; alterate condizioni possono avere effetto ancor prima che lo sviluppo sia incominciato. È il caso già riferito delle uova sovrammature di Anfibî studiate da E. Witschi. Si tratta, come è noto, di uova rimaste nell'utero materno, prima della fecondazione, più a lungo che di norma, cioè per 3-5 giorni. La fecondazione, dilazionata, è in genere polispermica: molte delle uova sono monospermiche e queste si sviluppano in embrioni duplici con appendici soprannumerarie, difettosi nella pigmentazione, con una spiccata tendenza alla formazione di tumori e altre anomalie (blastopori multipli) che il Witschi riferì ad alterazioni dello strato corticale dell'uovo conseguenti alla sovrammaturazione, per eccessivo accumulo di CO2. È del resto noto da tempo che, per un normale e regolare sviluppo delle uova di pollo, sono indispensabili buone condizioni di raccolta e di conservazione delle uova, una giusta temperatura ed un appropriato grado di umidità. Se le uova, prima dell'incubazione, hanno soggiaciuto a condizioni sfavorevoli, la percentuale delle schiuse è scarsa; frequenti sono gli arresti di sviluppo e la morte precoce degli embrioni, nonché tutta una varietà di altre anomalie che palesano l'irregolare sviluppo. Onde valutare quindi obbiettivamente i risultati di esperimenti destinati a controllare gli effetti teratogeni di varî fattori, è necessario essere sicuri che il materiale d'esperimento è stato tenuto, precedentemente e durante l'incubazione, nelle migliori condizioni.
W. Landauer e L. Baumann (1943) hanno inoltre dimostrato che la frequenza di malformazioni della regione caudale degli embrioni, da uova deposte dalla stessa gallina e sottoposte a vibrazioni meccaniche, è, durante i mesi estivi, maggiore che in primavera e che la micromelia (riduzione degli arti) si riscontra più frequentemente in autunno e al principio dell'inverno, piuttosto che in primavera e in inverno inoltrato.
Ben note ancora le anomalie di sviluppo che insorgono quando si fecondano le uova con spermî trattati in precedenza con varî agenti chimici (idrato di cloralio, stricnina, ecc.) o con irradiazioni (radium) come nella radium-ginogenesi e sono dovute all'influenza patologica della cromatina affetta degli spermi. Altrettanto noti gli effetti della fecondazione di uova di pollo con sperma "invecchiato" (A. Nalbandov e L. E. Card, 1943): una precoce mortalità degli embrioni, una scarsa percentuale di schiuse; le stesse uova sono più suscettibili ai varî trattamenti.
Negli esperimenti di t. la costituzione genetica del materiale d'esperimento deve essere tenuta nel massimo conto. Così il controllo della frequenza di malformazioni provocate dallo stesso agente, su specie diverse, va operato su materiale geneticamente omogeneo. Nel valutare le duplicità ottenute sperimentalmente sugli embrioni di trota e di Fundulus (C. R. Stockard, 1921), si deve tener conto che in trota, l'incidenza delle duplicità spontanee è assai maggiore che in Fundulus. Nell'induzione neurale la reazione dell'ectoderma di Amblystoma punctatum differisce da quella dell'ectoderma di Triturus torosus per una maggiore suscettibilità dell'ectoderma di Amblystoma che è connessa a una diversa resistenza delle membrane nucleari (J. Holtfreter, 1945).
In questo caso il diverso comportamento degli effetti neuralizzanti riguarda due generi diversi. Ma analoghe differenze si riscontrano in ceppi diversi della stessa specie. Così le anomalie scheletriche, determinate da diete deficienti, nel ceppo di ratti Sprague-Dawley (J. Warkany e coll. 1942) sono più frequenti che nel ceppo Wistar; gli embrioni di pollo di razza Livorno reagiscono all'insulina iniettata nel sacco del tuorlo (che produce l'anuria degli embrioni), in percentuale molto maggiore di quanto non si ottiene sperimentando su embrioni di altre razze. Si è potuto anzi dimostrare che è perfino possibile selezionare nella stessa razza Livorno bianca, una stirpe ad "alta" e un'altra a "bassa" suscettibilità all'insulina (2 unità dopo la quarta ora di incubazione) e si è giunti attraverso una prolungata selezione, a ottenere nella stirpe ad alta suscettibilità una frequenza del 51,9% di embrioni anuri, mentre nell'altra stirpe, a bassa suscettibilità, la malformazione si manifesta soltanto nel 18,2% dei casi (W. Landauer, 1948; W. Landauer e C. I. Bliss, 1946).
Ciò dimostra l'importanza della costituzione genetica del materiale d'esperimento sulle sue capacità reattive alle influenze teratogene. Che lo "stadio di sviluppo" su cui si agisce sia fattore della massima importanza nel determinismo delle anomalie o malformazioni è un fatto altrettanto noto. In genere gli stadî giovani reagiscono alle alterate condizioni ambientali o agli interventi diretti, in modo più accentuato di quelli avanzati. Ciò si può dedurre facilmente dall'alta mortalità e dalla frequenza dei casi di arresto di sviluppo che è dato constatare di regola negli stadî precoci. La malformazione, negli embrioni che sopravvivono, si presenta in genere con sorprendente regolarità, ciò che dimostra come gli abbozzi di quegli organi e strutture che risultano malformati siano particolarmente sensibili alla causa teratogena in un determinato stadio, e, in genere, per un periodo assai corto.
Se si fa poi subire lo stesso trattamento a embrioni di diversi stadî, non soltanto varia la frequenza di comparsa di una certa anomalia, ma se ne manifestano altre, ciò che esprime una "suscettibilità differenziale" dell'embrione nei varî stadî del suo sviluppo. Negli esperimenti già riferiti sugli effetti dell'insulina nell'embrione di pollo, si è potuto dimostrare che mentre fra le 0 e le 64 ore di incubazione l'anomalia più frequente è l'anuria, tra le 62 e le 168 ore, la malformazione che si manifesta in più alta percentuale è la micromelia.
Si è concordi nell'ammettere che la maggiore suscettibilità dell'embrione agli agenti teratogeni coincide con le fasi precoci di formazione degli abbozzi, quando ha luogo la loro determinazione. Da ricerche compiute su Fundulus heteroclitus (A. N. Solberg, 1938), trattando gli embrioni con raggi X, risulterebbe, tuttavia, una notevole differenza nel rapporto fra sensibilità ai raggi delle varie strutture e il momento in cui l'organo si abbozza: si può determinare così quale struttura è sensibile in un determinato stadio, quale in un altro.
Per quanto riguarda le duplicità degli embrioni, provocate da agenti teratogeni chimici o fisici, si è potuto dimostrare che le duplicità anteriori si ottengono più frequentemente operando negli stadî molto precoci dello sviluppo. Così per es., con i raggi U.V., si sono ottenute in Fundulus delle duplicità anteriori agendo sull'uovo 30 minuti prima dell'inizio della segmentazione (M. A. Hinrichs e I. T. Genther, 1931) ed è in questa fase che precede la segmentazione, che l'uovo si dimostra anche più sensibile alla centrifugazione.
Nello studio della chemioteratogenesi, delle malformazioni, cioè, ottenute, per azione di sostanze tossiche, spiccano per i Vertebrati, fra gli altri, i lavori di C. R. Stockard (1907), G. Leplat (1919), G. Cotronei (1915-19), F. E. Lehmann (1933) e P. Ancel (1945-1950). Dalle ricerche di Ancel risulta, ad es., che gli effetti della sulfanilamide sull'embrione di pollo (48 ore di incubazione) che provocano micromelia, si debbono ad un'azione perturbatrice di questa sostanza sul mesenchima precartilagineo. Facendo agire varie sostanze chimiche inducenti tale malformazione, questo autore ha potuto dimostrare che la suscettibilità ad esse si manifesta in stadî diversi e specialmente in quelli che corrispondono ad un più attivo differenziamento della cartilagine. La micromelia, con lo stesso trattamento con la sulfamilamide, si produce, tuttavia, anche agendo su embrioni di 120 ore.
Contrariamente a quanto comunemente si ammetteva, le ricerche di Ancel e collaboratori hanno messo in chiaro una specificità di azione di varî agenti chimici, che si riteneva provocassero invece le stesse malformazioni. Controllando, infatti, l'azione di circa 90 e più sostanze sull'embrione di pollo, nello stesso stadio e nelle stesse condizioni, si ebbero malformazioni diverse. Così ad es. con solfato di eserina e con altri composti solforati si otteneva micromelia e mai celosomia o anuria; invece la triplafavina provocava celosomia e mai micromelia o anuria; il trattamento con cacodilato di sodio, con metilarsonato di sodio, con saponina produceva anuria. Gli embrioni risentivano l'azione specifica di tali sostanze anche se si facevano agire contemporaneamente: per es. triplafavina e metilarsonato insieme, provocano lo sviluppo di embrioni anuri e privi di amnio, mentre la triplafavina, da sola, causa il mancato sviluppo dell'amnio senza anuria; il metilarsonato, da solo, determina sempre anuria senza alcuna malformazione nell'amnio. Veniva così appurata l'azione specifica di queste sostanze, non trascurando, s'intende, l'importanza dello stadio di sviluppo nel quale esercitavano la loro azione.
Conferme a questi risultati scaturirono da altri esperimenti, come ad es. quelli di V. Hamburger e K. Habel (1947) sull'azione di due differenti virus (virus influenzale A e virus della parotite epidemica) sull'embrione di pollo; tali virus penetrano e si moltiplicano nei tessuti dell'embrione ed allo stadio di 48 ore risultano ambedue tossici, ma soltanto quello dell'influenza ha effetti teratogeni con un'azione specifica, provocando specifiche malformazioni: microcefalia, micrencefalia, raddoppiamento dell'asse embrionale, anomalo accrescimento dell'amnio.
Nel valutare l'azione teratogena specifica di varie sostanze chimiche, in cui il fattore "stadio" di sviluppo ha sempre importanza determinante, si deve tener conto degli effetti tossici generali che sono causa di una mortalità non specifica degli embrioni. Si tratta di quegli effetti che si riscontrano negli embrioni che non sopravvivono al trattamento e muoiono precocemente in seguito a rottura dei vasi sanguigni nella regione extraembrionale e sono ritardati altresì nello sviluppo, principalmente nel territorio della regione cefalica. È necessario a questo proposito, discriminare gli effetti tossici determinanti le alterazioni del metabolismo che conducono al quadro descritto, dall'azione teratogena specifica della sostanza che si esplica sui superstiti.
Circa gli effetti della dose impiegata di un agente teratogeno, si suole in genere affermare che essi sono tanto più spiccati quanto più alta è la dose, ma ciò può dipendere sia da un aumento dell'intensità di azione al momento del trattamento, sia dalla sua maggior durata. Così sottoponendo l'embrione al trattamento, prima che sia avvenuta la determinazione di un certo abbozzo, prima cioè della fase critica di sviluppo, se permangono gli effetti del trattamento, le strutture che derivano da quell'abbozzo ne saranno particolarmente influenzate. Irradiando, con raggi X, ratti al 9°, 10° e 11° giorno di gestazione T. T. Job, G. I. Leibold e H. A. Fitzmaurice (1935), si ottennero neonati idrocefali con malformazioni degli occhi e delle mascelle. La stessa dose, ma fatta agire su uno stadio più avanzato, non provocava alcuna malformazione. Aumentando la dose, invece, si mostravano suscettibili anche gli stadî più tardivi fino al 16° giorno di gestazione (J. Warkany e E. Schraffenberger, 1947).
In generale si osserva che molti agenti teratogeni, in una percentuale di embrioni piuttosto alta, dànno gli effetti più spiccati a dosi tossiche, ma, per certe sostanze l'aumento della tossicità non determina necessariamente un aumento della teratogenicità. W. Landauer e C. I. Blis (1946), tuttavia, nell'embrione di pollo, avrebbero dimostrato che un aumento nella dose di insulina iniettata, produce un aumento di effetti teratogeni che supera quello della tossicità.
Riassumendo: nello studio delle alterazioni di sviluppo, che sono oggetto della t., e conducono ad anomalie, malformazioni e mostruosità, l'esperimento ha permesso di appurare che sia che queste alterazioni abbiano base genetica, sia che debbano la loro origine all'influenza di fattori ambientali, il meccanismo della loro insorgenza si deve ricondurre a turbe degli stessi fondamentali processi di sviluppo.
I fattori teratogeni sono, come si è veduto, quanto mai numerosi e varî. Dalla loro natura, dallo stadio di sviluppo nel quale agiscono, dalla intensità e dalla durata della loro azione sul materiale d'esperimento, dalle condizioni fisiologiche di questo, nonché dalla sua maggiore o minore sensibilità all'agente teratogeno, (insita alla sua costituzione genetica), dipendono entità e grado della deviazione dallo sviluppo normale. A tale deviazione, secondo il momento in cui interviene, possono concorrere: l'arresto di sviluppo localizzato di un abbozzo, fusioni di abbozzi, duplicazioni, mancati o alterati spostamenti di territorî embrionali limitrofi, mancate induzioni, superinduzioni, inibizioni, intervento di processi regolativi, ecc., tutto un complesso di turbe che agisce su un tipico piano topografico di abbozzi, modificando la morfogenesi normale. Come asserisce Et. Wolff: "lo sviluppo di una malformazione non comincia mai su un tema a capriccio, ma si può dire, senza paradosso, che una mostruosità è stata normale, prima di essere anormale".
Lo stesso abnorme sviluppo o uno simile, può verificarsi con i più diversi agenti teratogeni, ma, per alcuni di essi, applicati in determinati stadî, si è riusciti ad accertare una netta specificità d'azione. La tecnica delle lesioni localizzate, ha rappresentato anche un fruttuoso metodo per produrre sperimentalmente e a volontà una serie di malformazioni e mostruosità chiarendone il meccanismo di sviluppo.
Naturalmente alla base delle turbe responsabili della manifestazione teratologica, stanno intimi processi fisiologici e biochimici che lo studio della teratogenesi deve indagare, e questo ci suggerisce come la fisiologia dell'uovo e dell'embrione debba rappresentare la giusta via da percorrere in questo indirizzo.
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