sonda fluorescente

Sostanza molecolare che permette di rivelare selettivamente componenti particolari di sistemi biologici complessi, come tessuti e cellule, sia fissati che in coltura. Le s. f. , che sono centinaia, consentono di marcare, all'interno di una cellula viva, elementi subcellulari di interesse (organuli, proteine ecc.) o di misurare parametri cellulari importanti, come la concentrazione dello ione Ca²+, secondo messaggero intracellulare.

Abstract di approfondimento da Fluorescenza di Rosario Rizzuto (Enciclopedia della Scienza e della Tecnica)

La microscopia a fluorescenza, come approccio sperimentale per l’osservazione diretta di fenomeni biologici in cellule vive, ha registrato negli ultimi anni un marcato impulso, che ha beneficiato di due fattori: il progresso tecnologico degli strumenti di indagine, con lo sviluppo della microscopia confocale e dell’analisi matematica di immagini di fluorescenza tradizionale (imaging digitale), e lo sviluppo di sonde specifiche per marcare e seguire dinamicamente strutture cellulari o parametri fisiologici.

Due tipi di sonde, per la loro facilità d’uso e per le importanti applicazioni, hanno riscosso notevole successo: gli indicatori fluorescenti dello ione Ca²¹, che hanno esteso la determinazione di questo ione a tutti i tipi cellulari in coltura e in situ, e le proteine ricombinanti, che offrono il grande vantaggio di poter essere indirizzate selettivamente a distretti cellulari di interesse, tramite l’aggiunta di segnali di localizzazione specifici alla sequenza della proteina.

Nel corso degli ultimi decenni, un numero crescente di ricercatori ha intrapreso l’osservazione diretta dei processi essenziali della vita di una cellula, quali, per esempio, il movimento, la secrezione, la contrazione, la divisione o la morte. Almeno tre fattori hanno contribuito alla diffusione di questo approccio sperimentale. Il primo, indiretto, è stato l’enorme sviluppo della biologia molecolare, che ha permesso la ‘dissezione’ di processi complessi, come quelli sopra citati, e l’identificazione degli elementi molecolari che vi partecipano. In molti casi, l’analisi molecolare ha rivelato scenari complessi, identificando isoforme diverse della stessa proteina con distribuzione tissutale e proprietà funzionali distinte; tuttavia, il ruolo reale dei diversi attori molecolari in situ è ancora oscuro. Allo stesso tempo, le tecniche di biologia molecolare hanno aperto la possibilità di esprimere per via ricombinante una proteina eterologa, ossia di aggiungere una proteina specifica al repertorio naturale di una cellula. Si può così dotare di una particolare proteina (per es., una molecola segnale come una chinasi) una cellula che ne è sprovvista, oppure, esprimendo una forma mutata di una proteina endogena, verificare l’effetto di specifiche alterazioni biochimiche. Con un approccio un po’ più complesso, infine, si può distruggere il gene di una particolare proteina e studiare l’effetto della sua ablazione. In tutti i casi, lo studio diretto del processo di interesse nella cellula modificata ha una grande importanza e utilità.

Il secondo fattore di rilievo è stato lo sviluppo tecnologico, che ha permesso di realizzare microscopi e sistemi di analisi di immagine sempre più complessi. Risale agli anni Novanta del Novecento l’affermazione della microscopia confocale e lo sviluppo di algoritmi che permettono di calcolare, anche su immagini di fluorescenza tradizionale, il contributo al segnale dovuto alle porzioni non a fuoco del campione. Questi due approcci permettono di ottenere immagini a risoluzione e contrasto elevati anche da campioni complessi, come animali interi.

Un terzo elemento decisivo per sfruttare appieno le nuove tecnologie di analisi di immagine è la disponibilità di sonde che permettono di marcare, all’interno di una cellula viva, elementi subcellulari di interesse (organuli, proteine ecc.) o di misurare parametri cellulari importanti, come la concentrazione dello ione Ca²¹, secondo messaggero intracellulare. Anche se la prima dimostrazione del ruolo degli ioni Ca²¹ nel controllo di una funzione cellulare (la contrazione del muscolo cardiaco) risale a oltre un secolo fa, l’applicazione di questo meccanismo – che rappresenta oggi una nozione consolidata in biologia – a un’ampia varietà di funzioni e di tipi cellulari ha dovuto attendere lo sviluppo di specifici sitemi di misura della concentrazione di calcio ionizzato all’interno di una cellula. A questo scopo, sono risultate di grande utilità due categorie di molecole fluorescenti che hanno rivoluzionato il campo di studio della microscopia a fluorescenza: gli indicatori fluorescenti di parametri cellulari, molecole non proteiche intrappolabili nel citoplasma, di cui gli indicatori di Ca²¹ sono l’esempio più importante, e la green fluorescent protein (GFP, proteina a fluorescenza verde), una proteina della medusa Aequorea victoria. Con esse, va ricordata la fotoproteina equorina, che, pur essendo una proteina chemiluminescente e non fluorescente, ha un rilevante significato storico, in quanto è stata la prima proteina ricombinante utilizzata per la misura di un parametro fisiologico importante (la concentrazione di Ca²¹) e ha messo in luce le straordinarie potenzialità di questo approccio sperimentale.